СТРУКТУРА УГЛЕВОДНЫХ ЦЕЛЕЙ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ а 1-КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ИЗ АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА.


С. Д. Шиян, В. В. Насонов, Н. В. Бовин, В. А. Алешкин, Л. И. Новикова, А. Г. Лютое.

СТРУКТУРА УГЛЕВОДНЫХ ЦЕЛЕЙ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ а 1-КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ИЗ АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА.

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинни­кова РАН, Москва;  МИИИЭМ им. Г. Н. Габричевского МЗ РФ, Москва

Ключевые слова; ац-кислый гликопротеин, углеводные цепи; рак желудка.

Показано, что молекулярные формы аАГП различаются между собой содержанием двух-, трех- и четырехантенных углеводных N-цепей сложного тина. В то же время молекулярные формы аАГП отличались от нАГП большей микрогетерогенностью: в них увеличено содержание монодегалактоатягосахаридов, а также фрагментов Lex.

Неопластический рост клеток и ряд других заболеваний сопровождаются изменением уровня в крови некоторых белков, так называемых «белков острой фазы» [1-3]. Для многих из них найдены нарушения в степени и характере гликозилирования, индуцированные цитокинами [4-8 ]. Наиболее характерны изменения в сравнении с нормой в степени разветвленности N-цепей. Так, для а,-кислого гликопротеина (АГП) в зависимости от источника (кровь, асцитная жидкость или опухоль онкобольных) и вида заболевания (рак, цирроз печени, аллергические реакции) показаны изменения в соотношении двух-, трех- и четырехантенных цепей комплексного типа [5, б, 9, 10], количестве сайтов гликозилирования [10] и характере их замещения [11], а также различия в степени фукозилирования и сиалилирования углеводных цепей [7, 12].

Для многих белков острой фазы функциональные нарушения, связанные с уровнем гликозилирования, остаются невыясненными. Однако, например, изве­стно, что молекулярные формы АГП из крови здоровых доноров, различающиеся структурой углеводных цепей, имеют разную иммуномодулирующую активность [13-16 ]. Поэтому можно ожидать, что изменение содержания АГП или отдельных его молекулярных форм в организме больного существенно скажется на его иммунном статусе.

Действительно, для АГП, выделенных из донорской крови (нАГП), абортивной крови и асцитной жидкости больных раком желудка (аАГП), и их молекулярных форм показаны дозозависимые различия в их иммуномодулиртощих свойствах [15]. В АГП онкобольных (кровь и асцитная жидкость) перекрестным нммуно-аффинным электрофорезом с Con А и антисывороткой к АГП выявлено несколько молекулярных форм, соотношения между которыми отличаются от таковых в нормальной сыворотке крови [5, 6, 9 ]. Анализ структуры углеводных цепей АГП онкобольных обнаружил изменения в .соотношении N-цепен разной антен-ности и в степени микрогетерогенности [9, 12, 17]. В настоящей работе аАГП, выделенный нами ранее из асцитной жидкости больных раком желудка [9 ], был разделен на молекулярные формы, для которых проведен анализ структуры углеводных цепей.

Молекулярные формы АГП. Электрофоретически и иммунохимическн чистый аАГП с М 44 кДа, выделенный из асцитной жидкости онкобольных, отличался от нАГП по моносахаридному составу и соотношению четырех-, трех- и двух-антенных цепей сложного типа [9, 17 ]. Хроматографией на Соп-А-сефарозе в условиях работы [18] он был разделен на три формы: Соп-А-несвязываемую (аАГП-1, 70%) и две Con-A-связываемые (аАГП-2, 24%, и аАГП-3, 5%) формы. Все три формы были иммунохимическн идентичны нАГП и мало отличались по электрофоретической подвижности от аналогичных форм нАГП. По данным градиентного SDS-электрофореза, они имели М 44,0, 41,5 и 40,0 кДа, близкие молекулярным массам соответствующих форм нАГП (43,5, 41,2 и 39,5 кДа соответственно [18]). Однако в асците содержание Con-A-связываемых форм аАГП-2 и аАГП-3 было примерно вдвое выше, чем в норме.

 

Молекулярные формы аАГП различались между собой относительными мо­лекулярными массами, изоэлектрическими точками и содержанием углеводов; заметных различий в аминокислотном составе обнаружено не было (табл. 1). Содержание Gal и GIcNAc в аАГП и его формах было ниже, чем в аналогичных формах в норме; аАГП-2 и аАГП-3 различались по содержанию Fuc. Количество Neu5Ac, определенное тиобарбитуратным способом, в аАГП из пула и в Соп-А.-несвязываемой форме (аАГП-1) было близко таковому в нАГП и нАГП-1 •соответственно, тогда как в Con-A-связываемых формах (АГП-2 и АГП-3) оно было несколько ниже. Хотя детальный анализ сиалилирования разных форм АГП не являлся предметом настоящего исследования, некоторые отличия для аАГП обнаружены как при ВЭЖХ-анализе сиалосодержащих ОС, так и при спектральном анализе методом гигантского комбинационного рассеивания [19].

Анализ структуры N-связанных углеводных цепей аАГП и его молекулярных форм проводили методом, описанным ранее [18 ]: образцы АГП десиалилировали, отщепляли углеводные цепи гидразинолизом, превращали во флуоресцентные аминометилкумариновые производные (АМК-ОС), разделяли и анализировали обращенно-фазовой (оф) ВЭЖХ в изократическом режиме (система А) и в градиенте ацетонитрила в воде (система Б, рис. la). В результате было получено более 13 фракций АМК-ОС, каждую из которых анализировали эксклюзионной (э) ВЭЖХ, оценивали относительную молекулярную массу и определяли моно-сахаридный состав. Профили элюции и хроматографические характеристики каждого выделенного АМК-ОС из аАГП сравнивали с таковыми для нАГП [18] (табл. 2). Для подтверждения структуры АМК-ОС подвергали действию гликозидаз известной специфичности и анализировали полученные продукты расщепления с помощью ВЭЖХ аналогично тому, как описано в работах [9, 18].

Ранее нами был приведен суммарный состав олигосахаридов аАГП [9], ус­тановлено его сходство с составом нАГП и показано, что основными (около 75% в сумме) являются четырех-, трех- и двухантенные гликаны сложного типа (АМК-ОС (5), (7) и (9), рисунок, а, д). Олигосахариды аАГП в целом отличались от нАГП повышенным содержанием диантенных цепей (АМК-ОС (9)), фукози-лированных олигосахаридов (главным образом четырех- и трехантенных с фраг­ментом Galpl-4(Fucal-3)GlcNAc (Lex)) - АМК-ОС (10) и (12), а также недост­роенных агалактоолигосахаридов, АМК-ОС (6), ,(8) и (11). В то же время количество цепей с повторяющимся лактозаминовым блоком, АМК-ОС (1) - (4), в аАГП было несколько ниже, чем в нАГП (табл. 2).

показал их сходство с тремя аналогичными формами нАГП ([18], табл. 2) по содержанию углеводных цепей разной антенности (АМК-ОС (5), (7) и (9) на рисунке, б-г, и в табл. 2). Содержание цепей оценивали флуориметрически, считая, что общее количество их в АГП равно пяти: минимальное количество диантенных цепей было в аАГП-1 (менее 1 цеги на 1 моль АГП, рисунок, б), максимальное (не менее 3 цепей на 1 моль АГП) - в аАГП-3 (рисунок, г); аАГП-2 имел две диантенные цепи на 1 моль (рисунок, в, АМК-ОС (9)). Соотношение четырех- и трехантенных цепей между собой (АМК-ОС (5) и (7)) было близко 1 : 1 для всех трех форм (табл. 2).

Сравнение полученных данных о содержании асиалоолигосахаридов в раз­личных формах аАГП с таковыми в нАГП [18] показывает (табл. 2) их рас­хождение по двум параметрам. Во-первых, наличие в аАГП заметных количеств четырех-, трех- и двухантенных монодегалактоолигосахаридов (АМК-СО (6), (8) и (11)) (у одного из больных таких ОС в сумме до 20%), в то время как в составе нАГП обнаруживались лишь следы подобных ОС (до 3%). Агалакто-ОС содержались во всех трех формах аАГП, хотя и в разном соотношении; наибольшее их количество наблюдалось в четырехантенных цепях (табл. 2).

Вторым различающим параметром является содержание фукозилированных ОС. Хотя количество фукозилированных ОС как в нАГП [18], так и в аАГП [9] в целом было невелико, следует отметить, что в молекулярных формах аАГП содер­жание олигосахаридов (10) и (12) , несущих фрагмент Le* на четырех- и трехантенных цепях, было заметно выше, чем в нАГП (табл. 2). Небольшое количество диантенного ОС с фукозой в коре (АМК-ОС (13)) содержалось как в нАГП, так и в аАГП. В то же время ни в нАГП, ни в аАГП нами не обнаружены олигосахариды с несколькими фрагментами Le найденные недавно в АГП крови онкобольных [20 ].

Таким образом, детальный анализ структуры углеводных цепей разных пре­паратов АГП и его молекулярных форм выявляет несколько возможных факторов макро- и микрогетерогенности, которые могут влиять на взаимодействие гли-копротеина с клетками: 1) степень разветвленности (антенность) углеводных цепей, которая определяет конформацию самих углеводных цепей и, вероятно, влияет на конформацию всей молекулы АГП; 2) количество остатков Neu5Ac и, по-видимому, их презентация углеводными цепями разной антенности, а также тип связи с остатками Gal (а2-3 или ос2-6 в аАГП); 3) повышенное содержание фрагментов Lex и, следовательно, Neu5Ac-Lex в некоторых формах аАГП; 4) присутствие асиалоагалактоолигосахаридов в аАГП (см. табл. 2).

Последний фактор может быть весьма существенным для проявления иммуно-модулирующих свойств АГП, поскольку, с одной стороны, аАГП и его молекулярные формы отличаются по иммуносупрессивной активности от нАГП [15], а с другой - показано, что нАГП, углеводные цепи которого подвергнуты десиалилированию и дегалактозилированию in vitro, обладает более высокой иммуносупрессивной актив­ностью [21 ]. Поскольку сиалилированная форма Lex является лигандом се-лектинов - молекул, участвующих в адгезии нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток при острофазном ответе [22, 23 ], изменение экспрессии Neu5Ac-Lex на АГП влияет на его способность ингибировать селектинопосредованное взаимодействие лейкоцитов с другими клетками при острофазном ответе [12, 22]. Это, в свою очередь, влияет на иммуномодулирующие свойства АГП и развитие острофазного ответа [22, 23 ].

В заключение следует отметить, что выявленные изменения в структуре углеводных цепей аАГП по сравнению с нАГП могут быть обусловлены несколькими факторами. Так, различия в соотношении четырех-, трех- и двухантенных N-цепей связаны, по-видимому, с иным соотношением молекулярных форм АГП в асците: увеличение содержания диантенных цепей коррелирует с увеличением содержания Соп-А-свя-зываемых форм АГП (аАГП-2 и аАГП-3). Изменения в фукозилировании и сиа-лилировании аАГП обусловлены, по-видимому, экспрессией (и специфичностью) соответствующих гликозилтрансфераз и гликозидаз в гепатоцитах онкобольных [22]. Степень галактозилирования углеводных цепей аАГП может меняться в зависимости от активности и экспрессии соответствующих галактозилтрансфераз в гепатоцитах. В то же время нельзя забывать, что кроме АГП гепатоцитов, циркулирующих в крови, в асцит, вероятно, попадает АГП лейкоцитов и опухолевых клеток, различающиеся характером гликозилирования [10, 24]. Однако оценить вклад последних трудно из-за отсутствия необходимых данных о структуре их углеводных цепей.

Экспериментальная часть

Использовали те же реактивы и оборудование, что и в работах [9, 18]; моносиецифическую антисыворотку к АГП (Boehringwerke); аналитические ко­лонки Ultrasphere ODS (4,6 * 250 мм, Beckman) и TSK Gel G 2000 SW (7,5 x 300 мм, Altex); хроматографические системы: 12% CH3CN в Н20 (А), градиент 7-12% CH3CN в Н20 с 0,1% трифторуксусной кислоты (Б) (1 мл/мин, 25° С) и 7% водный этанол (0,2 мл/мин, 30 С) (В).

SDS-электрофорез, ВЭЖХ, получение олигосахаридов и их АМК-производных проводили как в работах [9, 18]. Содержание белка определяли по методу Брэдфорда [25 ], углеводов - фенол-сернокислотным методом [26 ], сиаловые кислоты - тиобарбитуратным методом [27 ]; использовали микромодификации методов согласно [9, 18].

аАГП выделяли из асцитной жидкости больных раком желудка III-IV стадии (низкодифференцированная аденокарцинома желудка, пул от 4 больных) как описано в работе [9 ]. 10 мг аАГП разделяли на молекулярные формы хрома­тографией на колонке (0,6x6 см) с Con-A-сефарозой 4В (Pharmacia), уравно­вешенной 0,02 М трис-НС1-буфером, рН 7,2, с 0,15 М NaCl, 1 мМ СаС12, 1 мМ МпС12 и 1 мМ MgCl2 аналогично работе [18]: аАГП-1 элюировали 10 объемами этого буфера; аАГП-2 - 0,15 М а-метилманнозидом (Sigma) в этом буфере; аАГП-3 элюировали 0,1 М Na-ацетатным буфером (рН 3,0) (на холоду); а-ме-тилманнозид удаляли гель-фильтрацией на биогеле Р-2 (1,5x40 см, Bio-Rad); в 0,5% АсОН; полученные фракции диализовали и лиофилизовали.

Для определения моносахаридного состава пробу, содержащую 0,05-0,1 нмоль олигосахарида, гидролизовали смесью 4 н. TFA - НО (1 : 1), pe-N-ацетилировали уксусным ангидридом в смеси пиридина с метанолом (5:1: 50) как в работе [9 ], превращали в АМК-производные и анализировали офВЭЖХ аналогично работе [18 ].

Ферментативное дегликозилирование проводили при 37° С в 0,1 М Na-аце-татном буфере в течение суток; брали 0,01 ед. акт. фермента на 0,1 нмоль олигосахарида в 50 мкл буфера: АМК-ОС (5) - (9) и (11) обрабатывали р-га-лактозидазой jeak bean при рН 3,5, р-гексозаминидазой jeak bean при рН 4,5; АМК-ОС (10), (12) и (13) инкубировали с ос-фукозидазой почки быка при рН 6,5; обрабатывали и анализировали как в работах [9, 18].

Работа субсидирована грантом Российского фонда фундаментальных исследо­ваний 93-04-6256.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bone С, Lauder /.//Brit. J. Cancer. 1974. V. 30. P. 215-221.

2. Cooper E. #., Stone /.//Adv. Cancer Res. 1979. V. 30. P. 1-43.

3. Алешкин В. А., Новикова Л. И., Лютое А. Г., Алешкина Т. #.//Клин. медицина. 1988. Т. 8.

С. 39-48.

4. Rudman D., Treadwell P. Е., Vogler W. R., Howard С. H., Hollins 5.//Cancer Res. 1972. V. 32.

P. 1951 - 1959.

5. Hansen J.-E. S., Larsen V. A., Bog-Hansen T. C.//Clin. Chem. Acta. 1987. V. 138. № 1. P. 41-47.

6. Bog-Hansen J. E., Bog-Hansen Т. C, Pederson P., Neland ^.//Electrophoresis.   1989.   V. 10.

P. 574-578.

7. Biou D., Konan D., Feger J., Agneray J., Leroy У., Cordon P., Fournet В., Duran C//Biochim. et

biophys. acta. 1987. V. 913. P. 308-312.

8. Новикова Л. И., Алешкин В. л.//Лабор. дело. 1991. Т. 6. С. 3-10."

ИЗО

9. Shiyan S. D., Nasonov V. V., Bovin N. V., Novikova L. I., Aleshkin V. A., Lyutov A. G.//Exp.

Onkol. 1993. V. 15. N 5. P. 53-61.

10. Chandrasekaran E. V., DavilaM., Nixon D., Mendicino D.//Cancer Res. 1984. V. 44. P. 1557-1567.

11. Treuheit M. J., Halsall H. B.//Chromatographie. 1993. V. 35. P. 90-92.

12. De Graaf T. W., Van der Stelt M. E., Anbergen M. G., van Dijk W./ll. Exp. Med. 1993. V. 177. P. 657-666.

13. FujU M., Takahashi N., Hayashi H., Matsunaga K, Yoshimi С./1СЫ. Biochem. 1987. V. 20. P. 183-189.

14. Fu/ii M., Takahashi N., Hayashi H., Furusho Т., Matsunaga K., Yoshikumi C.//Anticancer Res. 1988. V. 8. P. 303-306.

15. Shiyan S. D., NasonovV. V., Bovin N. V., Medvedev A. E.l/Exp. Oncol. 1993. V. 15. № 2. P. 46-50.

16. Pos O., Oostendorf R. A J., Van der Stelt M. E., Scheper R. /.//Inflammation. 1990. V. 14. № 2. P. 133-141.

17. Shiyan S. D., Nasonov V. V, Bovin N. K, Novikova L. I., Aleshkin V. A‘/‘/Glycoconj. J. 1991. V. 8. № 3. P. 188.

18. Шиян С. Д., Насонов В. В., Бовин-Н. В., Новикова Л. И., Алешкин В. Л.//Биоорган. химия. 1991. Т. 17. № 5. С. 663-670.

19. Sokolov К V., Byramova N. Е., Mochalova L. К, Tuzikov А. В., Shiyan S. D., Bovin N. V., Nabiev I. R.IIApplied Spectroscopy. 1993. V. 47. P. 535-538.

20. De Graaf T. W., Van der Stelt M. E., Anbergen M. G., van Dijk W.I ll. Exp. Med. 1993. V. 177. P. 657-666.

21. Bennet M., Schmid JCl/Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 6109-6113.

22. Walz G. A., Aruffo A., Kolanus W., Bevilacqua M., Seed ^.//Science. 1990. V. 250. P. 1132-1135.

23. Lasky L. A.l/1. Cell. Biochem. 1991. V. 45. P. 139-146.

24. Gahmberg C. G., Anderson L. C./ll. Exp. Med. 1978. V. 148. P. 507-521.

25. Bradford M.l/An&l. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

26. Du Bois M., Gilles K. S., Hamilton /. K., Smith F.l/Anrt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.

27. barren L.//S. Biol. Chem. 1959. V. 234. P. 1971 - 1975.

Поступила в редакцию 20.IX.1993 После доработки 17.XII.1993

S. D. Shiyan, V. V. Nasonov, N. V. Bovin, + V. A. Aleshkin[1], L. I. Novikova[2], A- G. Lutov

STRUCTURES OF THE CARBOHYDRATE CHAINS OF THE MOLECULAR FORMS OF a.-ACID GLYCOPROTEIN FROM ASCITIC FLUID OF STOMACH CANCER PATIENTS

M. M. Shemyakin and Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow; *G. N. Gabrichevski Institute of Epidemiology and Microbiology, Health Ministry