Прогностическая значимость аллелей PLA1 и PLA2 гена гликопротеина GPIIIa при раке предстательной железы.

Прогностическая значимость аллелей PLA1 и PLA2 гена гликопротеина GPIIIa при раке предстательной железы.

Лоран О.Б., Иткес А.В. , Серёгин А.А., Мяндина Г.И. Кафедра Урологии и Оперативной Андрологии Российской Медицинской Академии После­дипломного Образования на базе Городской Клинической Больницы имени С.П. Боткина Кафедра Биологии и Общей Генетики Российского Университета Дружбы Народов

Рак предстательной железы(РПЖ) - часто встречающееся злокачественное новообразование у муж­чин, характеризующееся неуклонным ростом заболеваемости и смертности [1, 2]. В России в 1996 году было впервые выявлено 8,3 тыс. случаев заболевания раком предстательной железы, что на 52% больше чем в 1989 году [3]. В США рак предстательной железы является наиболее частым злокаче­ственным новообразованием, составляя 30% от всех впервые диагностированных онкологических заболеваний у мужчин [4, 5].

В России, несмотря на улучшение ранней диагностики, у 40% пациентов при первичном обследовании имеются метастазы в кости. Кроме того, уже через 18-25 месяцев после начала антиан-дрогенной терапии у большинства больных развивается гормонорезистентность опухоли, прогрес-сирование ее роста и метастазирование [3, 6]. Большинство смертных случаев все еще обусловлено распространенным метастатическим процессом, устойчивым к лечению. Таким образом, на насто­ящий момент разработана система диагностики и хирургического лечения ранних стадий рака пред­стательной железы [7], однако отсутствует патогенетическое и, тем более, этиотропное лечение, так необходимое при поздних стадиях.

В тоже время, некоторые из диагностируемых опухолей оказываются небольшими, высоко-дифференцированными и неинвазивными. Они представляют невысокий риск для жизни и здоровья хозяина [8]. Эти опухоли трудно клинически диагностировать имеющимися средствами, и поэтому большинство урологов применяют агрессивное лечение даже небольших обнаруженных при био­псии опухолей, разумно полагая, что при биопсии часто происходит недооценка имеющейся степе­ни распространенности опухолевого поражения в предстательной железе.

По нашему мнению, современный подход к диагностике, выбору тактики лечения и прогнози­рования его результатов должен базироваться на глубоких знаниях молекулярных и генетических основ этиологии и патогенеза злокачественного процесса. В последнее время достигнуты большие успехи в изучении генетических факторов, влияющих на различные этапы канцерогенеза в предстательной железе [9]. Одним из исследовательских направлений является изучение клеточно-клеточного и клеточно-мат-риксного взаимодействия. Среди молекул клеточной адгезии наиболее хорошо изучена роль комплекса E-кадгерина с катенином [10]. Известно, что снижение экспрессии этого супрессора опухолевой инвазии и метастазирования ассоциируется с плохим клиническим прогнозом и наблюдается при низкодиффе-ренцированном раке. Среди других молекул клеточной адгезии несомненный интерес представляют интегрины.

Интегрины являются трансмембранными гликопротеинами клеточной поверхности, осуществ­ляющими рецепторную функцию. Интегрины выполняют также функцию проведения внутриклеточных сигналов, которые опосредуют влияние матрикса на экспрессию генов, движение, пролиферацию, диф-ференцировку, апоптоз и другие функции клетки. В настоящее время установлена центральная роль интегринов в развитии некоторых злокачественных опухолей человека. В первую очередь, это относится к различным формам меланомы и некоторых других злокачественных опухолей кожи [11]. Trikha показал связь экспрессии интегринов с процессом метастазирования рака предстательной железы у мышей [12]. Ген GP3a кодирует Ь3 субъединицу интегринового рецептора и локализован в длинном плече 17 хромосо­мы. Ген имеет 14 экзонов, в нем идентифицировано около 10 генных точечных мутаций, 5 различного рода перестроек и целый ряд делеций. Аллель PL-A2 представляет результат транзиции тиминового нук-леотида на цитозиновый в позиции 196 третьего экзона гена GP3a (PL-A1 - аллель дикого типа). Присут­ствие в генотипе указанного аллеля приводит к замене лейцина на пролин в позиции 33 р3-субъединицы интегрина. Частота встречаемости аллели PL-A2 составляет 13 - 14%.

Целью настоящего исследования является изучение роли аллели PL-A2 гена GP3a в развитии рака предстательной железы(РПЖ). В нашей работе мы применили новый патентованный (заявка на при­оритет от 05 марта 2004 года, регистрационный номер 2004106510) упрощенный способ выделения и исследования гена интегрина GP3a для оценки предрасположенности к раку предстательной железы.

Контингент больных, материалы и методы.рак простаты

Данные о пациентах. Было обследовано 90 больных раком предстательной железы, 30 человек составляли контрольную группу. Средний возраст больных - 69 лет (55-85). Диагноз был установлен на основании гистологического исследования образцов ткани, полученной в результате мультифокальной трансректальной биопсии простаты под ультразвуко­вым контролем и/или радикальной простатэктомии. Гистологические исследования выполнялись в лабо­ратории МНИОИ им. Герцена (руководитель - про­фессор Франк Г.А.). В зависимости от результатов клинического стадирования, больные РПЖ были раз­делены на 3 группы по 30 человек. В первую группу вошли пациенты с локализованным раком предста­тельной железы T1-2N0M0. Вторую группу состави­ли пациенты с местно распространенным процессом T3-4NxM0. Больные с метастатическим раком пред­стательной железы T3-4NxM+ вошли в третью груп­пу. Всем больным проводилось исследование крови на ПСА, ультразвуковое исследование органов моче­половой системы, общий анализ крови, мочи, биохи­мический анализ крови.

Методика обследования. В предлагаемом спо­собе выделения и исследования гена GP3a в качестве ДНК-матрицы используется не раствор ДНК, а сухая капля крови на бумажном носителе, в качестве носи­теля используется бумага Ватман 3ММ (Ватман, Ан­глия). Предложены оригинальные олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции, 5‘gctccaatgtacggggtaaa и 5‘ctcctcagacctccaccttg, кото­рые позволяют синтезировать специфический ДНК-продукт длиной 384 нуклеотидных пар. Этот продукт при расщеплении рестриктазой MspI образует фраг­менты ДНК длиной 290 и 80 нуклеотидных пар в слу­чае аллели PL-A1 и фрагменты длиной 170, 120 и 80 нуклеотидных пар в случае аллели PL-A2.

Исследование проводили следующим образом:

1. На подушечке безымянного пальца пациен­та скарификатором делали прокол кожи и выдавлива­ли каплю крови объемом 50 - 100 мкл.

2. Каплю крови переносили на квадратик (2 Г 2 см) хроматографической бумаги и высушивали на воздухе.

3. Фрагмент сухой капли размером 2 Г 3 мм вносили в стандартную смесь для полимеразной цеп­ной реакции объемом 50 мкл. Проводили полиме-разную цепную реакцию в стандартных условиях

4. Обрабатывали продукт полимеразной цеп­ной реакции рестриктазой MspI в соответствии с ин­струкцией для данного фермента.

5. Анализировали длину фрагментов ДНК ме­тодом стандартного электрофореза в полиакриламид-ном или агарозном геле и определяли наличие алле­лей PLA1 и/или PLA2.

Резулътаты и обсуждение. Анализ и оценка достоверности различий аллелъного распределение гена GP3A у больных раком предстательной железы (РПЖ), в группе контроля и в общей популяции.

В нашем исследовании у 120 мужчин был оп­ределен генотип гена GP3A. В таблице 1 приведены абсолютные и относительные частоты встречаемос­ти генотипов GP3A у пациентов РПЖ, в группе конт­роля и в популяции.

Анализ наблюдаемых и ожидаемых частот (ме­тод ч1) показал, что среди пациентов группы контро­ля частота встречаемости аллелей гена GP3A статис­тически не отличалась от таковой в популяции (p=0,85). Поэтому в дальнейшем статистический анализ паци­ентов РПЖ проводился при сравнении с популяци-онными частотами как статистически более коррект­ными.

Генотип P1A1A1Y был выявлен у 52 пациентов РПЖ, что составило 57,8±3,3%; генотип P1A1A2 - у 34 пациентов (37,8±5,0%) и генотип P1A2A2 у 4 больных (4,4± 5,5%). Таким образом, при анализе наблюдае­мых и ожидаемых частот (метод ч1) аллельное рас­пределение гена GP3A у больных РПЖ статистически значимо отличалось от такового в общей популяции (р< 0,01).

Таблица 1. Аллельное распределение гена GP3A при РПЖ в группе контроля и в популяции

N - число пациентов; P - достоверность различия между распределением аллелей в группе и в популяции; NA -

неприменимо

38

Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье» (2005) Т. 9, № 1

Анализ аллельного распределение гена GP3A у больных РПЖ в зависимости от стадии заболева­ния.

Для более подробного изучения влияния гено­типа GP3A на РПЖ мы проанализировали аллельное распределение гена GP3A в зависимости от стадии заболевания (таблица 2).

В группе больных с локализованным РПЖ вы­явлено 10 носителей аллелей P1A1A2, что составило 33±18%) и 20 носителей аллелей P1A1A1 (67±18%). Частота генотипа P1A1A1 в данной группе была дос­товерно выше частоты генотипа P1A1A2 (p=0,01). При этом распределение генотипов GP3A статистически не отличалось от популяционного (p=0,25).

У пациентов с местно-распространённым про­цессом отмечен рост выявления аллели PLA2 - в по­ловине случаев. Распределение генотипов статисти­чески отличалось от популяционного (p<0,01). Гено­тип P1A1A1 обнаружен у 15 больных (50± 19%), алле­ли P1A1A2 - у 12 пациентов (40±19%) и генотип P1A2A2 - у 3 пациентов (10±12%). Внутри группы частота P1A1A1 генотипа статистически не отлича­лась от частоты P1A1A2 (p=0,44), более того, среди больных с местно-распространенным РПЖ геноти­пы P1A1A2 (p=0,02) и P1A2A2 (p=0,02) встречаются достоверно чаще, а генотип P1A1A1 (p=0.01) реже, чем в популяции. Объем исследования не позволил уста­новить статистически значимую разницу между час­тотой носительства аллели P1A2 в группах локализо­ванного (10/60) и местно-распространённого РПЖ (18/ 60) (p=0.08).

В группе больных метастатическим раком пред­стательной железы распределение генотипов GP3A также статистически отличалось от популяционного (p=0,05). Генотип P1A1A1 был выявлен у 17 пациен­тов РПЖ (57±18%), генотип P1A1A2 - у 12 пациентов (40±19%) и генотип P1A2A2 у 1 больного (3±8%. Внут­ри этой группы частота генотипа P1A1A1 статисти­чески не отличалась от частоты генотипа P1A1A2 (p=0,2). Также как и среди больных с местно-распро-страненным РПЖ, генотип P1A1A2 (p=0,02) встреча­ется достоверно чаще, а генотип P1A1A1 (p=0,02) -реже, чем в популяции.

Вышеприведенные результаты показывают, что в группах больных инвазивным и метастатическим РПЖ статистически значимо повышена частота но-сительства генотипа PLA1A2 гена GP3A, что, по-ви­димому, свидетельствует о предрасположенности к развитию более злокачественных форм РПЖ у носи­телей аллели PLA2.

Анализ аллелъного распределение гена GP3A у больных РПЖ в зависимости от группы риска

Для определения распределения аллелей гена GP3A между пациентами с различными группами риска все обследованные были разделены на 4 стан­дартных группы в соответствии с критериями 3-й Международной Консультации по Раку Предстатель­ной Железы (Париж, 2002). Результаты анализа при­ведены в таблице 3.

В группе низкого риска (n=12) выявленное рас­пределение генотипа GP3A статистически не отлича­лось от популяционного (p=0,86). Генотип P1A1A1 обнаружен у 9 больных (75±37%). Аллели P1A1A2 определены у 3 пациентов (25±37%). Внутри группы частота P1A1A1 была статистически больше частоты генотипа P1A1A2 (p<0,05).

В группе больных с умеренным риском (n=21), выявленное распределение генотипа GP3A статисти­чески не отличалось от популяционного (p=0,63). Ге­нотип P1A1A1 выявлен у 15 пациентов (71±25%). Ге­нотип P1A1A2 обнаружен у 6 пациентов (29±25%). Внутри группы частота P1A1A1 генотипа статисти­чески не отличалась от частоты генотипа P1A1A2 (p=0,01).

У пациентов с высоким риском (n=23) распре­деление меняется и становится отличным от популя-ционного (p<0,005). Повышается пропорция больных с генотипом P1A1A2. Этот генотип выявлен у 10 па­циентов (43±26%). В свою очередь, генотип P1A1A1 обнаружен у 11 пациентов (48±26%), а генотип P1A2A2 у 2 пациентов (9±16%). Внутри группы частота

Таблица 2. Зависимость аллельного распределение гена GP3A от стадии РПЖ

P - достоверность различия между распределением аллелей в группе и в популяции; NA - неприменимо

Статьи

39

Таблица 3. Зависимость аллельного распределение гена GP3A от группы риска по РПЖ

P - достоверность различия между распределением аллелей в группе и в популяции; NA - неприменимо

P1A1A1 генотипа статистически не отличалась от ча­стоты генотипа P1A1A2 (p=0,73). Генотип P1A1A2 (p<0,05) встречался достоверно чаще, а генотип P1A1A1 (p<0,005) реже, чем в популяции.

Наконец, в группе пациентов с очень высоким риском (n=34) распределение также остается отлич­ным от популяционного (p<0,005) при примерно рав­ном соотношении генотипов: внутри группы частота P1A1A1 статистически не отличалась от частоты P1A1A2 (p=0,62). Генотип P1A1A1 обнаружен у 17 больных (50±20%). Аллели P1A1A2 определены у 15 пациентов (44±20%) и генотип P1A2A2 у 2 пациентов (6±11%). При этом частота генотипа P1A^2 была зна­чимо выше (р<0,005), а частота PLA^! ниже (р<0,001), чем в популяции.

Таким образом, распределение аллелей P1A1 и P1A2 гена GP3A при низком и умеренном риске про­грессии болезни не отличается от популяционного: носителей аллелей P1A1А1 больше, чем пациентов с генотипом P1A1A2. У больных с высоким риском прогрессии болезни аллельное распределение значи­мо отличается от популяционного: соотношение но­сителей генотипов P1A1А1 и P1A^2 примерно оди­наково, и, соответственно, частота генотипа P1A^2 выше, а генотипа P1A1А1 ниже, чем в популяции. С учетом этих результатов можно полагать, что носи-тельство генотипа P1A^2 является предрасполагаю­щим фактором к более быстрой прогрессии заболе­вания.

Заключение:

Нарушение функций интегринов может акти­вировать процессы, участвующих в канцерогенезе, в том числе ингибирование апоптоза, местную инва­зию и метастазирование. Проведенное нами иссле­дование показало, что носительства аллели PLA2 гена

GP3A является генетическим фактором риска забо­левания раком предстательной железы, в первую оче­редь, его инвазивными формами. Вероятность раз­вития локальной инвазии среди больных раком про­статы-носителей аллелей PLA2 примерно в 6 раз выше, чем у гомозигот по аллели PLA1. По всей видимости, течение болезни у носителей генотипа PLA1PLA2 ха­рактеризуется большей скоростью развития локаль­ной инвазии и метастазирования при сравнении с больными с генотипом PLA1PLA1. Данные результа­ты при подтверждении на большем количестве паци­ентов могут быть использованы в построении номог­рамм для прогнозирования инвазии клинически не­значимых опухолей.

Список литературы.

1. Руководство по урологии: В 3т./ под ред. Н.А. Лопаткина/ М., Медицина. - 1998. - Т.3: Рак предстательной железы. 503 с.

2. Гориловский Л.М., Толстова С.С. Рак предстательной железы// Избранные главы гериатрической урологии./ под ред. Л.М. Гориловского/ М., Ньюдиамед. - 2000. c. 202­226.

3. Аксель Е.М., Матвеев Б.П. Состояние онкоурологической помощи больным в России, 1997 г. Клиническая онкология 1999, 1(1): 3-5.

4. Jema1 A., Murray Т., Samue1s A., Ghafoor A., Ward E. and Thun M. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J C1in 2003; 53: 5-40.

5. Jema1 A., Thomas A., Murray T. and Thun M. Cancer statistics, 2002. CA Cancer J C1in 2002;

52: 23-56.

40

Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье» (2005) Т. 9, № 1

6. Матвеев Б.П., Бухаркин Б.В., Матвеев В.Б. Рак предстательной железы. М. 1999. 154 с.

7. Лоран О.Б., Пушкарь Д.Ю., Степанов В.Н., Крохотина Л.В. Дифференциальная диагнос­тика опухолей предстательной железы с помощью определения уровня простат-специфического антигена сыворотки кровию. М. 1999. 21 с.

8. Dunn J.K., Stamey T.A., Scardino P.T. The patho1ogic features and prognosis of prostate cancer detectab1e with current diagnostic tests. J Uro1 1994, 152: 1714-1717.

9. Gonsa1go M.L. and Isaacs W.B. Mo1ecu1ar pathways to prostate cancer. J Uro1 2003, 170:

2444-2452.

10. Cheng L, Nagabhushan M, Pret1ow TP, et a1. Expression of E-cadherin in primary and metastatic prostate cancer. Am J Patho1 1996; 148: 1375-1380.

11. Trikha M, Timar J, Zacharek A, Nemeth JA, Cai Y, Dome B, Som1ai B, Raso E, Ladanyi A, Honn KV. Ro1e for beta3 integrins in human me1anoma growth and surviva1. Int. J. Cancer

2002 Sep 10;101(2):156-67

12. Trikha M, Raso E, Cai Y, Fazakas Z, Paku S, Porter AT, Timar J, Honn KV. Ro1e of a1phaII(b)beta3 integrin in prostate cancer metastasis.

Prostate 1998 May 15;35(3):185-92