ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕИНАЗИНГИБИТОРНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА.

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕИНАЗИНГИБИТОРНОЙ СИСТЕМЫ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА.

A. M. Петросян,B. З. Харченко

Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского, Симферополь, АР Крьм, Украина

Резюме. У 60 первичных больных раком желудка без отдаленных метастазов (М) и с ними исследована сывороточная активность протеиназингибиторной системы до проведения хирургической операции. Установлено, что трипсиноподобная активность сыворотки крови по сравнению со здоровыми людьми достоверно снижена вне зависимости от наличия М. При этом между груп­пами больных существенных различий по уровню изучаемых показателей не выявлено. Зарегистрирована отрицательная корреляционная связь между ак­тивностью этих компонентов. Эластазоподобная активность и активность альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови снижалась у пациентов с отда­ленными М. У этой же группы пациентов выявлена отрицательная корреля­ционная связь между активностью альфа-1-антитрипсина и альфа-2-мак-роглобулина. Предложен индекс тяжести, в математической формуле объеди­няющий активность трех параметров сыворотки крови: трипсиноподобных ферментов, альфа-1-антитрипсина и альфа-2-макроглобулина. Так, индекс тяжести у больных с М в органах выше 77, в то время как у пациентов без отдаленных М он ниже указанной величины.

введение

 

Рак желудка (РЖ) остается по-прежнему од­ной из главных проблем онкологии. Так, в Укра­ине темпы заболеваемости РЖ занимают одно из ведущих мест среди европейских стран; ежегодно в нашей стране выявляют около 15-16 тыс. новых случаев [1, 2]. Особое значение в клинике прида­ют ранней диагностике и лечению рака желудка, воз­можности предупредить развитие метастазов (М). При этом при наличии признаков М в регионар­ных лимфатических узлах показано и радикальное оперативное вмешательство, в то время как при от­даленных М оправданы паллиативные операции, позволяющие лишь улучшить качество жизни па­циентов [3]. Современные методы исследования позволяют с высокой точностью определить нали­чие и степень развития первичной опухоли; однако в настоящее время отсутствует достаточное коли­чество методов для раннего выявления отдаленных М; даже такие прицельные методы, как лапарос­копия и лучевая диагностика, позволяют до опера­ции распознать лишь М по брюшине [4]. Поэтому все большее значение придают лабораторным ме­тодам, например определению изменений актив­ности сывороточных протеиназ и их ингибиторов в процессе опухолевого роста отдаленного мета-стазирования. Среди этих энзимов особый интерес представляют наиболее распространенные в орга­низме сериновые протеиназы, в том числе лока­лизованная в нейтрофильных лейкоцитах челове­ка гранулоцитарная эластаза. Попадая в кровяное русло, эластаза может разрушать белки плазмы кро­ви, тем самым нарушая процессы защиты и адапта­ции [5]. Известно, что прорастание опухоли в ок­ружающие ткани сопровождается локальной сек­рецией опухолевыми клетками протеолитических ферментов, расщепляющих белки межклеточного матрикса; тем самым создаются более благоприят­ные условия для инвазии [6]. На активность протеи-наз влияют не только скорость их образования, но и их инактивация специфическими ингибиторами [7]. Так, у пациентов с РЖ высокая экспрессия опу-холеассоцированного тканевого ингибитора трип­сина наиболее выражена на ранних стадиях разви­тия рака, что может служить благоприятным про­гностическим фактором [8]; в некоторых научных работах констатируется повышение общей протео-литической активности сыворотки крови, а также рост активности ингибиторов протеиназ - альфа-1-антихимотрипсина (ААХТ), альфа-1-антитрип-сина (ААТ) и альфа-2-макроглобулина (АМГ) [9, 10]. Ряд авторов установил повышение сывороточ­ного пула ААТ и ААХТ уже на начальных стадиях рака желудка; выявлена положительная корреляция между ростом этих показателей и тяжестью развития бо­лезни; установлено, что выполнение радикальной операции приводит к снижению активности этих ингибиторов, в то время как после паллиативного вмешательства их уровень остается стабильно вы­соким [11, 12]. По мере развития процесса может изменяться и активность АМГ [13], который вза­имодействует с факторами роста и дифференци-ровки клеток, тем самым, способствуя прогрессии опухоли. Снижение активности АМГ в сыворотке крови может служить критерием повышения злокачественности опухоли, которое проявляется ин-вазивным ростом и развитием М [14].

Задача данного исследования - определе­ние трипсиноподобной (ТПА), эластазоподобной (ЭПА) активности сыворотки крови (СК) больных с РЖ и изучение активности сывороточных инги­биторов - ААТ и АМГ, а также исследование кор­реляции этих показателей с тяжестью заболевания (в частности с наличием отдаленных метастазов).

объект и методы исследования

В исследование включены 60 первичных боль­ных с РЖ, проходивших обследование и лечение в Крымском республиканском клиническом онко­логическом диспансере, среди которых 24 женщи­ны (40%) и 36 мужчин (60%); по локализации РЖ: антральный отдел - 22 больных (36,7%), тело - 32 (53,3%), кардиальный и субкардиальный отде­лы - 4 (6,7%), 2 (3,3%) - с распространением опу­холи на антральную часть и тело желудка. Забор крови для исследования производили натощак, из периферической вены, накануне операции в 7- 9 ч утра. Контрольную группу составили 23 здоро­вых человека. Больных после постановки заключи­тельного диагноза разделены на две группы. В 1-ю (29 человек) вошли пациенты без признаков отда­ленного метастазирования: с I стадией (T1N0M0, T2N0M0) - 3, со II (T2N1M0, T3N0M0) - 11, с III (T3№M0, T3N1M0, T3N2M0, T4N0M0) - 14, с IV (T4N2M0) - 1. Во 2-ю группу включены пациенты с РЖ IV стадии с признаками отдаленного метастази­рования: 6 - T3N1M1, 8 - T3N2M1, 8 - T4N1M1, 7 - T4N2M1 и 2 - T4N3M1 (всего - 31).

Общую ТПА СК трипсиноподобных серино-вых протеиназ определяли по скорости расщепле­ния N-альфа-бензоил-Ь-аргинин-этилового эфи­ра (БАЭЭ), регистрируя прирост оптической плот­ности при 253 нм [16]. Оценку ЭПА проводили по гидролизу субстрата N-бутилоксикарбонил-Ь-ала-нин-п-нитрофенилового эфира (БАНЭ), кинетику расщепления которого определяли по приросту экс-тинкции при 347,5 нм [17]. Антитриптическую ак­тивность сыворотки крови изучали по методу, ос­нованному на подавлении ингибиторами, содер­жащимися в сыворотке крови (прежде всего ААТ), активности трипсина, остаточные значения кото­рой измеряли по расщеплению БАЭЭ; активность АМГ определяли по уровню расщепленного БАЭЭ трипсином, связавшимся с АМГ, и последующей инактивацией несвязавшегося с АМГ трипсина сое­вым ингибитором трипсина [18]. Все измерения оп­тической плотности проводили на спектрофотомет­ре «Termo» (Biomate, Великобритания).

Статистическую обработку полученных ре­зультатов проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel (Windows XP). Данные представле­ны в виде M ± m. Разницу отличий оценивали по критерию Стьюдента и считали достоверной при р < 0,05. Анализ корреляции между параметрами определяли по коэффициенту линейной корреля­ции Пирсона r, корреляцию считали достоверной при р < 0,05 [15].

результаты и их обсуждение

В обеих группах больных (как с отдаленными М, так и без них) выявлено достоверное снижение по сравнению с контролем СК ТПА (на 33,3%). В груп­пе пациентов с отдаленными М зарегистрировано снижение ЭПА по сравнению с контролем, в то вре­мя как у больных без отдаленного М этот показатель оставался без изменений. И в 1-й, и во 2-й группе больных по сравнению с контролем установлено достоверное повышение активности ААТ - на 82,5 и 79,3% соответственно. При исследовании актив­ности ингибитора протеиназ АМГ в 1-й группе по сравнению с группой здоровых людей выявлено не­значительное снижение этого показателя, в то вре­мя как во 2-й группе он достоверно снизился - на 29,3% (табл. 1).

Таблица 1

Показатели протеиназингибиторной системы СК здоровых людей и больных с РЖ

Группа		Показатель протеаиназингибиторной системы СК
		ТПА, мкМ/ млмин	ЭПА, %	ААТ, ИЕ/мл	АМТ, ИЕ/мл
Контроль (практически здоро­вые люди		0,48 ± 0,01	100,0	34,8 ± 2,0	4,1 ± 0,2
Больные с РЖ	1-я без отда­ленных М	0,32 ± 0,02 *p < 0,001 **p > 0,05	96,5 ± 5,5 *p > 0,05 **p < 0,05	63,5 ± 4,1 *p < 0,001 **p > 0,05	3,7 ± 0,2 *p > 0,05 **p < 0,01
	2-я с отдален­ными М	0,32 ± 0,02 *p < 0,001	80,4 ± 5,7 *p < 0,001	62,4 ± 2,8 *p < 0,001	2,9 ± 0,2 *p < 0,001

*Достоверность различий по сравнению с контрольной группой; "достоверность различий между группами больных с РЖ.

Между группами исследуемых пациентов не вы­явлено разницы по ТПА и ААТ, в то же время заре­гистрировано достоверное снижение ЭПА и АМГ в группе больных с отдаленными М по сравнению с группой без М (см. табл. 1).

Установлена отрицательная корреляционная связь между активностью ААТ и ТПА: общий коэф­фициент линейной корреляции r для всех больных составил -0,34 (р < 0,05), при этом для 1-й группы --0,33, для 2-й--0,37. У больных с отдаленными

М выявлена отрицательная корреляционная связь между ААТ и АМГ: r = -0,49 (р < 0,01).

 

Установленая достоверная разница между груп­пами больных по активности АМГ СК тем не менее не позволяет вывести абсолютное число, способное спрогнозировать отдаленное метастазирование еще до оперативного вмешательства и позволить поста­вить заключительный диагноз. Так, например, при средних величинах 1-й группы 3,7 ± 0,2 и 2-й - 2,9 ± 0,2 лишь у 6 больных без отдаленных М активность АМГ оказалась выше 5 ИЕ/мл, у остальных полу­ченные результаты находились в тех же пределах, что и у пациентов с отдаленным метастазированием. Поэтому более корректным, на наш взгляд, яв­ляется использование величины, способной объеди­нить сразу три параметра, характеризующие актив­ность протеиназингибиторной системы сыворотки крови - ТПА, АМГ и ААТ. Предлагаемый индекс тяжести (ИТ) заболевания больных с РЖ измеря­ется в абсолютных единицах и выражается следую­щей формулой:

ИТ= 100- ( ААТхАМГ_+ТПА)

При примении указанной формулы, выявле­на достоверная разница между группами больных (табл. 2); в группе пациентов без отдаленных М ИТ составил 76,9 ± 1,8, причем только в 48% случаев он был выше 77, в остальных 52% - равен этой вели­чине или ниже ее. Во 2-й группе ИТ составил 82,5 ± 0,9, при этом у 85% больных этот показатель был

выше 77 и лишь у 15% - незначительно ниже.

Таблица 2

Показатели ИТ у больных с РЖ

	Группа	ИТ
РЖ	1-я без отдаленных М	76,9 ± 1,8 *p < 0,01
	2-я с отдаленными М	82,5 ± 0,9 *p < 0,01

*Достоверность различий между группами больных с РЖ.

Поиск сопряженности двух показателей - от­даленного метастазирования и уровня ИТ - про­водили на основе анализа четырех статистичес­ких групп: а) с наличием отдаленных М и уровнем ИТ < 77; б) с наличием отдаленных М и уровнем ИТ > 77; в) с отсутствием отдаленного метастази­рования и уровнем ИТ < 77; г) с отсутствием от­даленного метастазирования и с уровнем ИТ > 77. Критерий согласия Пирсона х² составил 12,6 при его критическом значении 10,2 (р < 0,001), а коэф­фициент сопряженности Чупрова К при этом со­ставил 0,46, что еще раз подтверждает связь между фактом отдаленного метастазирования и условно принятым уровнем ИТ - 77. Таким образом пред­лагаемый нами ИТ может помочь в оценке тяжести развития РЖ: его величина меньше 77 с высокой долей вероятности свидетельствует об отсутствии отдаленных М и является благоприятным прогнос­тическим признаком. Напротив, высокие цифры ИТ отражают прогрессирование процесса, в част­ности отдаленное метастазирование.

Различная активность ингибиторов протеиназ - высокий уровень ААТ и снижение АМГ - свидетельствуют о роли этих белков в патогенезе злокачественного процесса. Так, рост опухоли, ее инвазия, как указывалось выше, сопровождаются активацией компонентов системы протеолиза: в тканях растет активность трипсина, химотрипси-на, тромбина, эластазы и коллагеназы, повышается в крови содержание плазмина и компонентов кал-ликреин-кининовой системы. Рост в крови глав­ного ингибитора этих ферментов - ААТ - свиде­тельствует об ее усиленной секреции, которая, по сути, является адекватным ответом на повышенную активность протеиназ. Установленная отрицатель­ная корреляционная связь между активностью ААТ и ТПА подтверждает, что у больных с РЖ происхо­дит нарушение баланса в протеиназингибиторной системе и смещением в сторону повышения ак­тивности ингибиторов, что является своеобразным компенсаторным механизмом, способным снизить процесс роста первичной опухоли. Отмечали, что уровень активности ААТ стабильно высокий почти у всех пациентов с РЖ, вне зависимости от нали­чия регионарных и отдаленных М. Уровень ТПА, напротив, достоверно ниже контроля у пациентов обеих групп, причем степень этого понижения у них практически одинакова. Следовательно, рост опухоли и ее метастазирование в ткани и органы не находят специфичного отражения в показате­лях активности ААТ и ТПА. Возможно, дисбаланс в системе протеаза-ингибитор претерпевает волно­образные изменения: выраженное повышение ак­тивности трипсиноподобных ферментов, происхо­дящее во время роста опухолевых клеток, приводит к адекватному повышению активности ингибито­ра - ААТ, что в свою очередь снижает процессы протеолиза и уровень ТПА. Этим, возможно, объ­ясняется тот факт, что у некоторых больных заре­гистрирован уровень ААТ в пределах контрольных цифр и, напротив, более высокие по сравнению со здоровыми людьми показатели ТПА.

Отдаленные метастазы рака желудка характеризуют­ся с одной стороны тем, что происходит срыв ком­пенсаторно-приспособительных реакций организ­ма в результате истощения его резервных возмож­ностей, а с другой стороны при прогрессировании болезни растет вклад АМГ в ингибиторный потен­циал. Возможно, это еще одна попытка макроорга­низма не только блокировать часть протеаз (в час­тности эластазоподобных), секретируемых опухо­левыми клетками, но и сохранить белки СК. Сами же комплексы АМГ-протеазы не задерживаются в крови, именно поэтому, вероятно, у пациентов с отдаленными М регистрируется снижение сыво­роточной активности АМГ и ЭПА.

выводы

1. У больных с РЖ (с отдаленными М и без них) установлено по сравнению со здоровыми людьми достоверное и идентичное снижение ТПА СК; по­нижение уровня ЭПА СК зарегистрировано только у пациентов с отдаленными М.

2. В обеих группах больных активность ААТ СК достоверно снижена; зависимости изменений этого показателя от регионарного или отдаленного мета-стазирования не выявлено. Активность АМГ СК до­стоверно снижена у пациентов с отдаленными М.

3. У всех больных вне зависимости от метаста-зирования в органы выявлена отрицательная кор­реляционная связь между активностью ААТ и ТПА: повышение ААТ приводит к снижению ТПА, и на­оборот. У больных с отдаленными М определена аналогичная корреляция между активностью ААТ

и АМГ.

4. По математической формуле, объединяющей три параметра - ТПА, ААТ и АМГ, предложен ИТ болезни, по которому установлена достоверная раз­ница между группами больных с отдаленными М и без них: в группе пациентов с IV стадией заболева­ния подавляющее большинство имело данный ин­декс выше 77.

литература

1. Correa P, Chen V. Gastric cancer. Cancer Surveys. 1994; 19-20: 55-76.

2. Sipponen P, Marshall BJ. Gastritis and gasric cancer - western countries. Gastroenterol. Clin North Am 2000; 29:

579-92.

3. Слинчак СМ. Рак желудка. Киев: Здоров‘я, 1972. 200 с.

4. Шаназаров НА. Рак желудка / Под ред проф АВ Важе-ниной / Учебное пособие Уральской Государственной ме­дицинской академии дополнительного образования. Челя­бинск, 2001. 29 с.

5. Нешкова ЕА. Гранулоцитарные сериновые протеина-зы и их действие на калликреин-кининовую систему плаз­мы крови человека [Автореф дис ... канд биол наук]. Моск­ва, 1994. 18 с.

6. Оглоблина ОГ, Арефьева ТИ. Роль протеолитических ферментов и их ингибиторов в инвазии злокачественных опухолей. Биохимия, 1994; (3): 340-52.

7. Харченко ВЗ. Экспериментальное обоснование пато­генетической фармакотерапии турникетного шока анти-протеиназными средствами [Автореф дис ... д-ра мед наук]. Киев, 1990. 40 с.

8. Wiksten JP, Lundin J, Nordling S, et al. High tissue expression of tumour-associated trypsin inhibitor (TATI) associates with a more favourable prognosis in gastric cancer. Histopathol 2005; 46 (4): 380-8.

9. Chawla RK, Rausch DJ, Miller FW, et al. Abnormal profile of serum proteinase inhibitors in cancer patients. Cancer Res 1984;

44 (6): 2718-23.

10. Millan J, Lorenzo A, Gallurt P, et al. ROC analysis of diagnostic performance utilizing serum antiproteases in cancer patients. Int J Biol Markers 1988; 3 (3): 203-5.

11. Bernacka K, Kuryliszyn-Moskal A, Sierakowski S. The

levels of alpha 1-antitrypsin and alpha 1-antichymotrypsin in the sera of patients with gastrointestinal cancers during diagnosis. Cancer 1988; 62 (6): 1188-93.

12. Bernacka K, Kuryliszyn-Moskal A, Klimiuk PA. Serum alpha-1-antitrypsin and alpha-1-antichymotrypsin after surgical treatment and during postoperative clinical course of human gastric cancer. Neoplasma 1993; 40 (2): 111-6.

13. Осипов ВД. Роль неспецифических опухолевых мар­керов и клинико-морфологических показателей в диагнос­тике и лечении предрака и раннего рака гортани [Автореф дис ... д-ра мед наук]. Томск, 2006. 23 с.

14. Баженова ЛГ, Шрамко СВ, Зорина ВН и др. Белки острой фазы (а2-макроглобулин и IgG) в сыворотке кро­ви при воспалительных опухолеподобных поражениях при­датков матки и опухолях яичников. Медицина в Кузбассе

2006; (1): 71-4.

15. Зайцев ВМ, Лифляндский ВГ, Маринки ВИ. Приклад­ная медицинская статистика. Санкт-Петербург: Фолиант,

2003. 432 с.

16. Пасхина ТС, Доценко ВЛ, Блинникова ЕИ. Калликреиноген сыворотки крови человека. Метод определения и не­которые свойства. Биохимия 1973; 38 (2): 420-3.

17. Оглоблина ОГ, Платонова ЛВ, Мясникова ЛВ и др. Ак­тивность протеиназ гранулоцитов и уровень кислотостабиль-ных ингибиторов протеиназ в бронхоальвеолярном секрете детей с бронхопатиями различной этиологии. Вопр мед хи­мии 1980; (3): 387-92.

18. Нартикова ВФ, Пасхина ТС. Унифицированный метод определения активности а1-антитрипсина и а2-макроглобу-лина в сыворотке (плазме) крови человека. Вопр мед химии 1979; 25 (4): 494-9.