С. Д. Шиян, В. В. Насонов, Н. В. Бовин, В. А. Алешкин, Л. И. Новикова, А. Г. Лютое.
СТРУКТУРА УГЛЕВОДНЫХ ЦЕЛЕЙ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ФОРМ а 1-КИСЛОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ИЗ АСЦИТНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА.
Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва; МИИИЭМ им. Г. Н. Габричевского МЗ РФ, Москва
Ключевые слова; ац-кислый гликопротеин, углеводные цепи; рак желудка.
Показано, что молекулярные формы аАГП различаются между собой содержанием двух-, трех- и четырехантенных углеводных N-цепей сложного тина. В то же время молекулярные формы аАГП отличались от нАГП большей микрогетерогенностью: в них увеличено содержание монодегалактоатягосахаридов, а также фрагментов Lex.
Неопластический рост клеток и ряд других заболеваний сопровождаются изменением уровня в крови некоторых белков, так называемых «белков острой фазы» [1-3]. Для многих из них найдены нарушения в степени и характере гликозилирования, индуцированные цитокинами [4-8 ]. Наиболее характерны изменения в сравнении с нормой в степени разветвленности N-цепей. Так, для а,-кислого гликопротеина (АГП) в зависимости от источника (кровь, асцитная жидкость или опухоль онкобольных) и вида заболевания (рак, цирроз печени, аллергические реакции) показаны изменения в соотношении двух-, трех- и четырехантенных цепей комплексного типа [5, б, 9, 10], количестве сайтов гликозилирования [10] и характере их замещения [11], а также различия в степени фукозилирования и сиалилирования углеводных цепей [7, 12].
Для многих белков острой фазы функциональные нарушения, связанные с уровнем гликозилирования, остаются невыясненными. Однако, например, известно, что молекулярные формы АГП из крови здоровых доноров, различающиеся структурой углеводных цепей, имеют разную иммуномодулирующую активность [13-16 ]. Поэтому можно ожидать, что изменение содержания АГП или отдельных его молекулярных форм в организме больного существенно скажется на его иммунном статусе.
Действительно, для АГП, выделенных из донорской крови (нАГП), абортивной крови и асцитной жидкости больных раком желудка (аАГП), и их молекулярных форм показаны дозозависимые различия в их иммуномодулиртощих свойствах [15]. В АГП онкобольных (кровь и асцитная жидкость) перекрестным нммуно-аффинным электрофорезом с Con А и антисывороткой к АГП выявлено несколько молекулярных форм, соотношения между которыми отличаются от таковых в нормальной сыворотке крови [5, 6, 9 ]. Анализ структуры углеводных цепей АГП онкобольных обнаружил изменения в .соотношении N-цепен разной антен-ности и в степени микрогетерогенности [9, 12, 17]. В настоящей работе аАГП, выделенный нами ранее из асцитной жидкости больных раком желудка [9 ], был разделен на молекулярные формы, для которых проведен анализ структуры углеводных цепей.
Молекулярные формы АГП. Электрофоретически и иммунохимическн чистый аАГП с М 44 кДа, выделенный из асцитной жидкости онкобольных, отличался от нАГП по моносахаридному составу и соотношению четырех-, трех- и двух-антенных цепей сложного типа [9, 17 ]. Хроматографией на Соп-А-сефарозе в условиях работы [18] он был разделен на три формы: Соп-А-несвязываемую (аАГП-1, 70%) и две Con-A-связываемые (аАГП-2, 24%, и аАГП-3, 5%) формы. Все три формы были иммунохимическн идентичны нАГП и мало отличались по электрофоретической подвижности от аналогичных форм нАГП. По данным градиентного SDS-электрофореза, они имели М 44,0, 41,5 и 40,0 кДа, близкие молекулярным массам соответствующих форм нАГП (43,5, 41,2 и 39,5 кДа соответственно [18]). Однако в асците содержание Con-A-связываемых форм аАГП-2 и аАГП-3 было примерно вдвое выше, чем в норме.
Молекулярные формы аАГП различались между собой относительными молекулярными массами, изоэлектрическими точками и содержанием углеводов; заметных различий в аминокислотном составе обнаружено не было (табл. 1). Содержание Gal и GIcNAc в аАГП и его формах было ниже, чем в аналогичных формах в норме; аАГП-2 и аАГП-3 различались по содержанию Fuc. Количество Neu5Ac, определенное тиобарбитуратным способом, в аАГП из пула и в Соп-А.-несвязываемой форме (аАГП-1) было близко таковому в нАГП и нАГП-1 •соответственно, тогда как в Con-A-связываемых формах (АГП-2 и АГП-3) оно было несколько ниже. Хотя детальный анализ сиалилирования разных форм АГП не являлся предметом настоящего исследования, некоторые отличия для аАГП обнаружены как при ВЭЖХ-анализе сиалосодержащих ОС, так и при спектральном анализе методом гигантского комбинационного рассеивания [19].
Анализ структуры N-связанных углеводных цепей аАГП и его молекулярных форм проводили методом, описанным ранее [18 ]: образцы АГП десиалилировали, отщепляли углеводные цепи гидразинолизом, превращали во флуоресцентные аминометилкумариновые производные (АМК-ОС), разделяли и анализировали обращенно-фазовой (оф) ВЭЖХ в изократическом режиме (система А) и в градиенте ацетонитрила в воде (система Б, рис. la). В результате было получено более 13 фракций АМК-ОС, каждую из которых анализировали эксклюзионной (э) ВЭЖХ, оценивали относительную молекулярную массу и определяли моно-сахаридный состав. Профили элюции и хроматографические характеристики каждого выделенного АМК-ОС из аАГП сравнивали с таковыми для нАГП [18] (табл. 2). Для подтверждения структуры АМК-ОС подвергали действию гликозидаз известной специфичности и анализировали полученные продукты расщепления с помощью ВЭЖХ аналогично тому, как описано в работах [9, 18].
Ранее нами был приведен суммарный состав олигосахаридов аАГП [9], установлено его сходство с составом нАГП и показано, что основными (около 75% в сумме) являются четырех-, трех- и двухантенные гликаны сложного типа (АМК-ОС (5), (7) и (9), рисунок, а, д). Олигосахариды аАГП в целом отличались от нАГП повышенным содержанием диантенных цепей (АМК-ОС (9)), фукози-лированных олигосахаридов (главным образом четырех- и трехантенных с фрагментом Galpl-4(Fucal-3)GlcNAc (Lex)) - АМК-ОС (10) и (12), а также недостроенных агалактоолигосахаридов, АМК-ОС (6), ,(8) и (11). В то же время количество цепей с повторяющимся лактозаминовым блоком, АМК-ОС (1) - (4), в аАГП было несколько ниже, чем в нАГП (табл. 2).
показал их сходство с тремя аналогичными формами нАГП ([18], табл. 2) по содержанию углеводных цепей разной антенности (АМК-ОС (5), (7) и (9) на рисунке, б-г, и в табл. 2). Содержание цепей оценивали флуориметрически, считая, что общее количество их в АГП равно пяти: минимальное количество диантенных цепей было в аАГП-1 (менее 1 цеги на 1 моль АГП, рисунок, б), максимальное (не менее 3 цепей на 1 моль АГП) - в аАГП-3 (рисунок, г); аАГП-2 имел две диантенные цепи на 1 моль (рисунок, в, АМК-ОС (9)). Соотношение четырех- и трехантенных цепей между собой (АМК-ОС (5) и (7)) было близко 1 : 1 для всех трех форм (табл. 2).
Сравнение полученных данных о содержании асиалоолигосахаридов в различных формах аАГП с таковыми в нАГП [18] показывает (табл. 2) их расхождение по двум параметрам. Во-первых, наличие в аАГП заметных количеств четырех-, трех- и двухантенных монодегалактоолигосахаридов (АМК-СО (6), (8) и (11)) (у одного из больных таких ОС в сумме до 20%), в то время как в составе нАГП обнаруживались лишь следы подобных ОС (до 3%). Агалакто-ОС содержались во всех трех формах аАГП, хотя и в разном соотношении; наибольшее их количество наблюдалось в четырехантенных цепях (табл. 2).
Вторым различающим параметром является содержание фукозилированных ОС. Хотя количество фукозилированных ОС как в нАГП [18], так и в аАГП [9] в целом было невелико, следует отметить, что в молекулярных формах аАГП содержание олигосахаридов (10) и (12) , несущих фрагмент Le* на четырех- и трехантенных цепях, было заметно выше, чем в нАГП (табл. 2). Небольшое количество диантенного ОС с фукозой в коре (АМК-ОС (13)) содержалось как в нАГП, так и в аАГП. В то же время ни в нАГП, ни в аАГП нами не обнаружены олигосахариды с несколькими фрагментами Le найденные недавно в АГП крови онкобольных [20 ].
Таким образом, детальный анализ структуры углеводных цепей разных препаратов АГП и его молекулярных форм выявляет несколько возможных факторов макро- и микрогетерогенности, которые могут влиять на взаимодействие гли-копротеина с клетками: 1) степень разветвленности (антенность) углеводных цепей, которая определяет конформацию самих углеводных цепей и, вероятно, влияет на конформацию всей молекулы АГП; 2) количество остатков Neu5Ac и, по-видимому, их презентация углеводными цепями разной антенности, а также тип связи с остатками Gal (а2-3 или ос2-6 в аАГП); 3) повышенное содержание фрагментов Lex и, следовательно, Neu5Ac-Lex в некоторых формах аАГП; 4) присутствие асиалоагалактоолигосахаридов в аАГП (см. табл. 2).
Последний фактор может быть весьма существенным для проявления иммуно-модулирующих свойств АГП, поскольку, с одной стороны, аАГП и его молекулярные формы отличаются по иммуносупрессивной активности от нАГП [15], а с другой - показано, что нАГП, углеводные цепи которого подвергнуты десиалилированию и дегалактозилированию in vitro, обладает более высокой иммуносупрессивной активностью [21 ]. Поскольку сиалилированная форма Lex является лигандом се-лектинов - молекул, участвующих в адгезии нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток при острофазном ответе [22, 23 ], изменение экспрессии Neu5Ac-Lex на АГП влияет на его способность ингибировать селектинопосредованное взаимодействие лейкоцитов с другими клетками при острофазном ответе [12, 22]. Это, в свою очередь, влияет на иммуномодулирующие свойства АГП и развитие острофазного ответа [22, 23 ].
В заключение следует отметить, что выявленные изменения в структуре углеводных цепей аАГП по сравнению с нАГП могут быть обусловлены несколькими факторами. Так, различия в соотношении четырех-, трех- и двухантенных N-цепей связаны, по-видимому, с иным соотношением молекулярных форм АГП в асците: увеличение содержания диантенных цепей коррелирует с увеличением содержания Соп-А-свя-зываемых форм АГП (аАГП-2 и аАГП-3). Изменения в фукозилировании и сиа-лилировании аАГП обусловлены, по-видимому, экспрессией (и специфичностью) соответствующих гликозилтрансфераз и гликозидаз в гепатоцитах онкобольных [22]. Степень галактозилирования углеводных цепей аАГП может меняться в зависимости от активности и экспрессии соответствующих галактозилтрансфераз в гепатоцитах. В то же время нельзя забывать, что кроме АГП гепатоцитов, циркулирующих в крови, в асцит, вероятно, попадает АГП лейкоцитов и опухолевых клеток, различающиеся характером гликозилирования [10, 24]. Однако оценить вклад последних трудно из-за отсутствия необходимых данных о структуре их углеводных цепей.
Экспериментальная часть
Использовали те же реактивы и оборудование, что и в работах [9, 18]; моносиецифическую антисыворотку к АГП (Boehringwerke); аналитические колонки Ultrasphere ODS (4,6 * 250 мм, Beckman) и TSK Gel G 2000 SW (7,5 x 300 мм, Altex); хроматографические системы: 12% CH3CN в Н20 (А), градиент 7-12% CH3CN в Н20 с 0,1% трифторуксусной кислоты (Б) (1 мл/мин, 25° С) и 7% водный этанол (0,2 мл/мин, 30 С) (В).
SDS-электрофорез, ВЭЖХ, получение олигосахаридов и их АМК-производных проводили как в работах [9, 18]. Содержание белка определяли по методу Брэдфорда [25 ], углеводов - фенол-сернокислотным методом [26 ], сиаловые кислоты - тиобарбитуратным методом [27 ]; использовали микромодификации методов согласно [9, 18].
аАГП выделяли из асцитной жидкости больных раком желудка III-IV стадии (низкодифференцированная аденокарцинома желудка, пул от 4 больных) как описано в работе [9 ]. 10 мг аАГП разделяли на молекулярные формы хроматографией на колонке (0,6x6 см) с Con-A-сефарозой 4В (Pharmacia), уравновешенной 0,02 М трис-НС1-буфером, рН 7,2, с 0,15 М NaCl, 1 мМ СаС12, 1 мМ МпС12 и 1 мМ MgCl2 аналогично работе [18]: аАГП-1 элюировали 10 объемами этого буфера; аАГП-2 - 0,15 М а-метилманнозидом (Sigma) в этом буфере; аАГП-3 элюировали 0,1 М Na-ацетатным буфером (рН 3,0) (на холоду); а-ме-тилманнозид удаляли гель-фильтрацией на биогеле Р-2 (1,5x40 см, Bio-Rad); в 0,5% АсОН; полученные фракции диализовали и лиофилизовали.
Для определения моносахаридного состава пробу, содержащую 0,05-0,1 нмоль олигосахарида, гидролизовали смесью 4 н. TFA - НО (1 : 1), pe-N-ацетилировали уксусным ангидридом в смеси пиридина с метанолом (5:1: 50) как в работе [9 ], превращали в АМК-производные и анализировали офВЭЖХ аналогично работе [18 ].
Ферментативное дегликозилирование проводили при 37° С в 0,1 М Na-аце-татном буфере в течение суток; брали 0,01 ед. акт. фермента на 0,1 нмоль олигосахарида в 50 мкл буфера: АМК-ОС (5) - (9) и (11) обрабатывали р-га-лактозидазой jeak bean при рН 3,5, р-гексозаминидазой jeak bean при рН 4,5; АМК-ОС (10), (12) и (13) инкубировали с ос-фукозидазой почки быка при рН 6,5; обрабатывали и анализировали как в работах [9, 18].
Работа субсидирована грантом Российского фонда фундаментальных исследований 93-04-6256.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bone С, Lauder /.//Brit. J. Cancer. 1974. V. 30. P. 215-221.
2. Cooper E. #., Stone /.//Adv. Cancer Res. 1979. V. 30. P. 1-43.
3. Алешкин В. А., Новикова Л. И., Лютое А. Г., Алешкина Т. #.//Клин. медицина. 1988. Т. 8.
С. 39-48.
4. Rudman D., Treadwell P. Е., Vogler W. R., Howard С. H., Hollins 5.//Cancer Res. 1972. V. 32.
P. 1951 - 1959.
5. Hansen J.-E. S., Larsen V. A., Bog-Hansen T. C.//Clin. Chem. Acta. 1987. V. 138. № 1. P. 41-47.
6. Bog-Hansen J. E., Bog-Hansen Т. C, Pederson P., Neland ^.//Electrophoresis. 1989. V. 10.
P. 574-578.
7. Biou D., Konan D., Feger J., Agneray J., Leroy У., Cordon P., Fournet В., Duran C//Biochim. et
biophys. acta. 1987. V. 913. P. 308-312.
8. Новикова Л. И., Алешкин В. л.//Лабор. дело. 1991. Т. 6. С. 3-10."
ИЗО
9. Shiyan S. D., Nasonov V. V., Bovin N. V., Novikova L. I., Aleshkin V. A., Lyutov A. G.//Exp.
Onkol. 1993. V. 15. N 5. P. 53-61.
10. Chandrasekaran E. V., DavilaM., Nixon D., Mendicino D.//Cancer Res. 1984. V. 44. P. 1557-1567.
11. Treuheit M. J., Halsall H. B.//Chromatographie. 1993. V. 35. P. 90-92.
12. De Graaf T. W., Van der Stelt M. E., Anbergen M. G., van Dijk W./ll. Exp. Med. 1993. V. 177. P. 657-666.
13. FujU M., Takahashi N., Hayashi H., Matsunaga K, Yoshimi С./1СЫ. Biochem. 1987. V. 20. P. 183-189.
14. Fu/ii M., Takahashi N., Hayashi H., Furusho Т., Matsunaga K., Yoshikumi C.//Anticancer Res. 1988. V. 8. P. 303-306.
15. Shiyan S. D., NasonovV. V., Bovin N. V., Medvedev A. E.l/Exp. Oncol. 1993. V. 15. № 2. P. 46-50.
16. Pos O., Oostendorf R. A J., Van der Stelt M. E., Scheper R. /.//Inflammation. 1990. V. 14. № 2. P. 133-141.
17. Shiyan S. D., Nasonov V. V, Bovin N. K, Novikova L. I., Aleshkin V. A‘/‘/Glycoconj. J. 1991. V. 8. № 3. P. 188.
18. Шиян С. Д., Насонов В. В., Бовин-Н. В., Новикова Л. И., Алешкин В. Л.//Биоорган. химия. 1991. Т. 17. № 5. С. 663-670.
19. Sokolov К V., Byramova N. Е., Mochalova L. К, Tuzikov А. В., Shiyan S. D., Bovin N. V., Nabiev I. R.IIApplied Spectroscopy. 1993. V. 47. P. 535-538.
20. De Graaf T. W., Van der Stelt M. E., Anbergen M. G., van Dijk W.I ll. Exp. Med. 1993. V. 177. P. 657-666.
21. Bennet M., Schmid JCl/Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. V. 77. P. 6109-6113.
22. Walz G. A., Aruffo A., Kolanus W., Bevilacqua M., Seed ^.//Science. 1990. V. 250. P. 1132-1135.
23. Lasky L. A.l/1. Cell. Biochem. 1991. V. 45. P. 139-146.
24. Gahmberg C. G., Anderson L. C./ll. Exp. Med. 1978. V. 148. P. 507-521.
25. Bradford M.l/An&l. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.
26. Du Bois M., Gilles K. S., Hamilton /. K., Smith F.l/Anrt. Chem. 1956. V. 28. P. 350-356.
27. barren L.//S. Biol. Chem. 1959. V. 234. P. 1971 - 1975.
Поступила в редакцию 20.IX.1993 После доработки 17.XII.1993
S. D. Shiyan, V. V. Nasonov, N. V. Bovin, + V. A. Aleshkin[1], L. I. Novikova[2], A- G. Lutov
STRUCTURES OF THE CARBOHYDRATE CHAINS OF THE MOLECULAR FORMS OF a.-ACID GLYCOPROTEIN FROM ASCITIC FLUID OF STOMACH CANCER PATIENTS
M. M. Shemyakin and Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow; *G. N. Gabrichevski Institute of Epidemiology and Microbiology, Health Ministry