НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ЛЕГКОГО: КЛИНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОПУХОЛИ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ.

НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ЛЕГКОГО: КЛИНИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ОПУХОЛИ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ХИРУРГИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ.

К.К.Лактионов, М.И.Давыдов, Б.Е.Полоцкий, Д.И.Юдин, С.М.Волков, И. Б.Зборовская,Е. В. Степанова, В. Н. Богатырев.

НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

За несколько последних десятилетий достигнут значитель­ный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деле­ния и смерти, поддержания генетической стабильности, пере­дачи сигнала от рецепторов в ядро и т. д. Оказалось, что струк­турные и функциональные изменения некоторых белков, участвующих в этих процессах (онкобелков и супрессоров опу­холевого роста), могут приводить к трансформации клеток. Межклеточные взаимодействия, регулирующие состояние и поведение нормальных клеток, определяют также способ­ность опухолевых клеток к инвазии и метастазированию. На сегодняшний день известно более 100 белков и их генов, изменения которых связаны с ростом злокачественных ново­образований. Эти белки и гены и получили название молеку-лярно-биологических (молекулярных) маркеров опухолей. Все они участвуют в регуляции клеточного цикла, апоптоза, диф-ференцировки и морфогенетических реакций клетки.

Таким образом, опухолевые маркеры - это гены и их про­дукты, связанные с развитием злокачественных заболеваний и используемые для диагностики и определения стадии злока­чественных новообразований, а также для их скрининга. Кро­ме того, исследование опухолевых маркеров часто применяют для определения скрытого метастазирования, мониторинга эффективности химиотерапии, диагностики рецидива болезни и оценки метастатического потенциала опухоли.

Используя современные молекулярные и иммунологичес­кие методы, можно исследовать индивидуальные генетические и биологические особенности опухоли, которые позволяют прогнозировать течение болезни и резистентность к химиоте­рапии независимо от гистологического типа опухоли.

Рак легкого (РЛ) - одно из самых серьезных онкологичес­ких заболеваний. Рост заболеваемости РЛ в последние годы оправдывает наихудшие прогнозы ВОЗ и наносит огромный социально-экономический ущерб. В 35 развитых странах мира и в Российской Федерации РЛ остается главной причиной смертности онкологических больных. Годовой прирост заболе­ваемости РЛ в России в настоящее время составляет 3,4%, еже­годно заболевают более 60 000 человек [5].

На сегодняшний день прогнозирование течения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) после радикального хирурги­ческого лечения базируется прежде всего на оценке распро­страненности опухоли. Однако даже в отсутствие регионарных лимфогенных метастазов 5-летняя выживаемость составляет 50-70% [5]. Групповой прогноз не удовлетворяет современ­ным требованиям клинической онкологии, не позволяет оце­нить биологические особенности опухоли у данного больного и индивидуализировать мониторинг и лечебную тактику.

Изучение генома опухолевой и нормальной клеток позво­лило накопить большой объем данных, касающихся генетиче­ских характеристик при различных гистологических типах РЛ. Структурные и функциональные изменения онкогенов в ряде случаев имеют прогностическое значение. Наиболее значимыми в этом отношении являются онкогены семейств myc и ras. Ядерные онкогены семейства myc играют важную роль в дифференцировке, росте и программированной гибели клеток. Ген L-myc имеет 2 аллеля (L и S), появление второго аллеля обусловлено точечной герминальной мутацией. В связи с этим существуют 3 варианта генотипа - LL, LS, SS. Обнару­жено, что при НМРЛ наличие аллеля S сочетается с быстрым прогрессированием и диссеминацией опухоли, но не коррели­рует с дифференцировкой опухоли [14; 15; 18; 19].

Гены семейства ras, в том числе H-ras, относятся к наиболее часто экспрессируемым протоонкогенам и участвуют в переда­че внутриклеточных сигналов. Особого внимания заслуживает обнаруживаемый в норме полиморфизм аллелей гена c-Ha-ras, обусловленный присутствием области вариабельных тандем-ных повторов в нетранслируемой части гена. Четыре из них определены как «общие» (а1; а2; а3; а4). Выявлена связь аллеля а4 гена c-Ha-ras с высоким риском развития активно метаста-зирующих опухолей [3; 13; 18].

Среди генов, отвечающих за тканевую совместимость, осо­бой сложностью структуры, высоким полиморфизмом и важно­стью продуктов индукции характеризуется главный комплекс гистосовместимости (HLA). Гены HLA I класса обеспечивают иммунный ответ [3; 10].

На основании собственных наблюдений (78 больных НМРЛ, радикально оперированных в хирургическом торакаль­ном отделении РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН) было отмече­но, что о неблагоприятном прогнозе свидетельствует выявле­ние аллеля а4 гена с-На-ras, SS-генотип L-myc и отсутствие экспрессии молекул HLA I класса на поверхности клеток. Сре­ди благоприятных факторов прогноза следует отметить выявле­ние аллелей а1; а2 и а3 гена с-На-ras; LL- и LS-генотипа L-myc и экспрессию эффекторных молекул HLA I класса.

В зависимости от наличия или отсутствия неблагоприятных генетических и иммунологических факторов прогноза с уче­том распространенности опухоли больные были распределены на 2 группы. При наличии неблагоприятных факторов прогно­за 1; 2 и 3 года прожили 76,9; 38,4 и 30,7% больных, у которых после радикального хирургического лечения регионарных метастастазов выявлено не было, при наличии благоприятных - 81,2; 81,2 и 81,2% соответственно (рис. 1).

Оценивая полученные данные, следует отметить высокую информативность изученных факторов в прогнозировании ре­зультатов хирургического лечения больных НМРЛ с одинако­вой распространенностью опухолевого процесса, что до сих пор представлялось весьма затруднительным.

Учитывая полученные результаты, мы сочли необходимой дальнейшую индивидуализацию прогноза и изучили дополни­тельные молекулярно-генетические факторы на однородной клинико-морфологической группе. Мы проанализировали вы­живаемость 49 больных дифференцированным плоскоклеточным РЛ T2N0M0, оперированных в хирургическом торакоабдоминальном от­делении РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Изучение прогностиче­ской значимости факторов генетической нестабильности (де-леции различных локусов короткого плеча 1-й хромосомы, плоидность опухоли), экспрессии мутантного р53, VEGF (vas­cular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия), Bcl-2, Вах и пролиферативной активности опухолевых клеток (соот­ношение клеток в разных фазах клеточного цикла) выполня­лось на однородном клиническом материале.

Ключевым белком, регулирующим механизмы естествен­ной гибели клетки, является белок - супрессор опухолевого роста р53, необходимый для активации некоторых форм апоптоза [6; 17; 18]. VEGF является главным фактором, инду­цирующим образование новых сосудов в опухоли. Он стиму­лирует деление и миграцию эндотелиальных клеток близлежа­щих сосудов. Экспрессия VEGF свидетельствует о высоком метастатическом потенциале опухоли [7; 8]. Семейство генов Bcl участвует в регуляции апоптоза. Лучше всего изучена экс­прессия белков - антагонистов Bcl-2 и Bax. Экспрессия Bcl-2 при плоскоклеточном РЛ (25-40% случаев) наблюдается ча­ще, чем при аденокарциноме легкого (около 10% случаев). Бе­лок Вах является стимулятором апоптоза. Bcl-2 и Вах связыва­ются между собой и ингибируют друг друга. При анализе экспрессии Bcl-2 и Вах замечено, что они редко экспрессиру-ются вместе [9].

Делеции различных локусов короткого плеча 1-й хромосо­мы часто обнаруживаются при НМРЛ. Эти мутации обычно выявляются на поздних стадиях заболевания и могут иметь прогностическое значение. Предполагается, что короткое пле­чо 1-й хромосомы содержит ген или гены-супрессоры, инакти­вация которых приводит к прогрессии НМРЛ [3].

С помощью ДНК-проточной цитометрии с высокой досто­верностью можно определить плоидность опухолевых клеток и оценить их распределение по фазам клеточного цикла. Дип­лоидные (с нормальным содержанием ДНК) солидные опухо­ли, в том числе и РЛ, отличаются более благоприятным про­гнозом, чем анеуплоидные (с более высоким содержанием ДНК). Опухоли с высоким содержанием клеток в S-фазе кле­точного цикла, как правило, характеризуются быстрым ростом и высокой метастатической активностью [5].

Все больные были разделены на 2 группы. Первую составили 25 человек, которые прожили менее 3 лет (неблагоприятный прогноз), 2-ю - 24 больных, проживших более 5 лет (благопри­ятный прогноз). Группы не различались по общепринятым клинико-морфологическим параметрам: полу, возрасту, дли­тельности анамнеза, стороне поражения, локализации опухо­ли, клинико-анатомической форме, дифференцировке и раз­меру первичной опухоли, а также по объему хирургического вмешательства.

Таблица 1 / Table 1

Распределение прогностических факторов при плоскоклеточном РЛ T2N0M0 в зависимости от общей выживаемости, % Distribution of prognositc factors with respect to overall survival in squamous-cell LC T2N0M0, %

Монофакторный анализ показал, что значимыми независи­мыми неблагоприятными факторами прогноза при плоскоклеточном РЛ являются экспрессия мутантного p53 и VEGF, от­сутствие экспрессии Bcl-2 и Bax, делеция короткого плеча 1-й хромосомы, анеуплоидия и высокая доля опухолевых клеток в S-фазе клеточного цикла (табл. 1). С учетом данных моно­факторного анализа подсчитано, насколько исследованные факторы влияют на продолжительность жизни больных плос­коклеточным РЛ (рис. 2). Наиболее значительно ее увеличива­ют отсутствие экспрессии VEGF и экспрессия Bcl-2 (весовые коэффициенты 14,19 и 13,37 соответственно), а уменьшают - анеуплоидия и высокое содержание опухолевых клеток в S-фа­зе клеточного цикла (весовые коэффициенты -13,36 и -8,61 соответственно).

Интересными, на наш взгляд, представляются результаты сравнения фактической продолжительности жизни с расчет­ной, вычисленной по весовым коэффициентам изученных факторов прогноза (рис. 3). Они демонстрируют высокую точ­ность оценки продолжительности жизни по данному методу. Так, в наблюдениях, когда расчетная продолжительность жиз­ни не превышала 40 мес, точность прогноза составила 92,6%, при прогнозируемой продолжительности жизни более 40 мес все больные пережили 5-летний срок наблюдения. Ошибка метода в целом не превысила 4,1% и была связана с 2 случаями заниженной расчетной продолжительности жизни. Удаление из регрессионного анализа даже одного фактора прогноза при­водит к значительному увеличению ошибки (от 8,1% при ис­ключении из анализа экспрессии Bax до 12,2% при исключе­нии анеуплоидии и экспрессии VEGF).

Исследование позволило выявить различия в биологических особенностях плоскоклеточного РЛ при одинаковых морфо-клинико-анатомических характеристиках новообразований. Только комплексное использование молекулярно-генетичес-ких параметров увеличивает точность индивидуального про­гноза результатов хирургического лечения больных дифферен­цированным плоскоклеточным РЛ T2N0M0 и, следовательно, позволяет оптимизировать лечебную тактику и повысить каче­ство наблюдения за больными.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Абелев Г. И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - С. 127-138.

2. Давыдов М.И., Полоцкий Б. Е. Рак легкого. - М.: Радикс, 1994.

3. Зборовская И. Г., Татосян А. Г.Молекулярно-генетические марке­ры при раке легкого: онкогены и гены-супрессоры // Новое в тера­factors on life time of squamous-cell LC was assessed by multi-factorial analysis (fig. 2). The absence of VEGF and the presence of Bcl-2 expression (weight coefficients 14.19 and 13.37 respec­tively) were found to have the greatest positive effect on life time while aneuploidy and high percentage of S-phase cells (weight coefficients -13.36 and -8.61 respectively) produced the greatest negative effect.

Рисунок 2. Влияние молекулярно-генетических марке­ров на общую выживаемость при дифференцированном плоскоклеточном РЛ T2N0M0.

I - экспрессия мутантного p53; II - экспрессия Bcl-2; III - от­сутствие экспрессии Bax; IV - отсутствие экспрессии VEGF; V - отсутствие делеции короткого плеча 1-й хромосомы; VI - анеуплоидия; VII - высокое содержание клеток в S-фазе кле­точного цикла.

Figure 2. Effect of molecular genetic markers on overall sur­vival in differentiated squamous-cell LC T2N0M0.

I - mutant p53 expression; II - Bcl-2 expression; III - no Bax expression; IV - no VEGF expression; V - no chromosome 1 short arm deletion; VI - aneuploidy; VII - high percentage of S-phase cells.

Рисунок 3. Сравнение прогнозируемой (1) и фактической (2) продолжительности жизни больных плоскоклеточным РЛ T2N0M0.

Figure 3. Comparison of predicted (1) and actual (2) lifetime values in patients with squamous-cell LC T2N0M0.

пии рака легкого. - М., 1997. - C. 5-17.

Коган Е. А., Жак Г., Кайзер У. и др. Иммуногистохимия биомолекуляр­ных маркеров рака легкого // Арх. пат. - 1997. - Т. 6. - С. 23-30. Полоцкий Б. Е. Рак легкого: Дис... д-ра мед. наук. - М., 1995. Чумаков П. М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смер­тью // Биохимия. - 2000. - Т. 65. - С. 34-47. Abu-Jawdeh G. M., Faix J. D., Niloff J. et al. Strong expression of vascu­lar permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its recep­tors in ovarian borderline and malignant neoplasms // Lab. Invest. - 1996. - Vol. 74. - P. 1105-1115.

Anseletti C. A., Lucchi M., Fontanini G. et al. Prognostic significance of tumoral angiogenesis in completely resected late stage lung carcinoma (stage IIIA-N2) // Cancer. - 1996. - Vol. 78. - P. 409-415. Apolinario R., van der Valk P., de Jong J. et al. Prognostic value of the expression of p53, bcl-2 and bax oncoproteins and neovascularization in patients with radically resected non-small-cell lung cancer // J. Clin. Oncol. - 1997. - Vol. 15. - P. 2456-2466.

10. BarberL., Parchem P. Peptide binding to major histocompatibilitycomplex molecules // Ann. Ref. Cell. Biol. - 1993. - Vol. 9. - P. 163-206.

11. Chen Y., Sato M., Fujimura S. et al. Expression of Bcl-2, Bax and p53 proteins in cancerogenesis of squamous cell lung cancer //Anticancer Res. - 1999. - Vol. 19. - P. 1351-1356.

12. Graziano S. L. Non small cell lung cancer: clinical valve of new biological

predictors // Lung Cancer. - 1997. - Vol. 17. - P. 537-558.

13. Heighway J., Thatcher N., Cerny T. et al. Genetic predisposition of human lung cancer // Brit. J. Cancer. - 1986. - Vol. 53. - P. 453-457.

14. Kawashima K., Nomura S., Hirai H. et al. Correlation of the L-myc RFLP with metastasis, prognosis and multiple cancer in lung-cancer patients// Int. J. Cancer. - 1991. - Vol. 50. - P. 557-561.

sion resulted in a significant rise in the error value (from 8.2% after exclusion of Bax expression to 12.2% after exclusion of ane­uploidy and VEGF expression).

Our study discovered differences in biological features of squamous-cell LC with similar morphological, clinical and anatomical characteristics. Complex molecular genetic study improves accuracy of individual prognosis for patients with differentiated squamous-cell LC T2N0M0 undergoing surgery and therefore contributes to optimization of treat­ment policy.

15. Kern J., Schwartz D., Nordberg J. et al. p185 neo expression in human lung adenocarcinomas predicts shortened survival // Cancer Res. - 1990. - Vol. 50. - P. 5184-5191.

16. Kwun M. F., Yoshitaka S., John D. M.Molecular pathogenesis of lung cancer // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. - 1999. - Vol. 118. -

P. 1136-1152.

17. Levine A. J. p53 the cellular gatekeeper for growth and division // Cell. - 1997. - Vol. 88. - P. 323-331.

18. Weston A., Caporaso N. et al. Relationship of Ha-ras-1, L-myc and p53 polymorphism with lung cancer risk and prognosis // Envir. Health Perspect. - 1992. - Vol. 98. - P. 61-67.

19. Yokota J., Wada M., Yoshida T. et al. Heterogeneity of lung cancer cell with respect to amplification of mic family // Oncogene. - 1988.- Vol. 2. - P. 607-611.

Поступила 22.12.2004 / Received 22.12.2004

2

23