Главная / РАК ПОЧКИ / АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ.

АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ.

На правах рукописи

МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2008 год

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ежегодно в мире регистрируют около 200 тыс. новых случаев рака почки и почти 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии. В России диагностируют до 9 тыс. случаев опухолей почки в год, более 90% которых приходятся на почечно-клеточные карциномы - рак почки (РП). По темпам прироста заболеваемости РП уступает только новообразованиям предстательной и щитовидной желез [Алексеев Б.Я., 2007].

В настоящее время диагностика и прогноз РП основываются на данных инструментальных методов исследования и патоморфологических критериях, что далеко не всегда позволяет правильно оценить прогноз заболевания и возможности лечения [Yin-Goen 2006]. Это обусловливает необходимость создания эффективных тест-систем для проведения своевременной лабораторной диагностики, мониторинга и определения прогноза течения РП. Необходимым этапом создания системы маркеров РП является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных опухолях почки. В качестве таких повреждений генома опухолевых клеток могут выступать мутации, потеря гетерозиготности и аберрантное метилирование ряда генов-супрессоров.

Ген VHL инактивируется в большинстве случаев самого распространенного морфологического типа РП - светлоклеточного рака почки (СРП) вследствие соматических мутаций, метилирования промотора и потери гетерозиготности [Banks R.E., 2006]. Также при СРП выявляют аллельные делеции других генов-супрессоров. Вопрос о влиянии мутаций и метилирования VHL и делеций генов-супрессоров в области 3р (VHL, RASSF1, FHIT) на прогрессию первичной опухоли и прогноз заболевания остается открытым. Идентифицирован ряд генов-супрессоров, аберрантное метилирование которых наблюдается в различных морфологических типах опухолей [Lovisolo J.A., 2006]. Анализ наиболее часто метилируемых генов будет способствовать созданию системы диагностических и прогностических маркеров РП.

Опубликованы данные об исследованиях полиморфизмов различных генов при РП [Karami S., 2008]. Некоторые полиморфизмы могут представлять интерес как потенциальные маркеры предрасположенности к спорадическому РП в популяции европейской части России или влиять на течение заболевания.

РП практически не чувствителен к лучевой и химиотерапии, поэтому хирургическое удаление опухоли является основным методом лечения РП. Определенные успехи связаны с внедрением в практику таргетных препаратов, механизм действия которых напрямую связан с генетическими нарушениями в опухолевых клетках [Costa L.J., 2007]. В связи с этим вопрос о лечении метастатического РП и местнораспространенных форм заболевания требует максимально точной оценки прогноза развития первичной опухоли, знания ее особенностей на молекулярно-генетическом уровне.

Таким образом, комплексное исследование соматических мутаций, потери гетерозиготности, метилирования 5‘-регуляторных областей генов-супрессоров и полиморфных вариантов генов, задействованных в развитии РП, будет способствовать формированию системы новых молекулярно-генетических маркеров РП.

Целью исследования является комплексный молекулярно-генетический анализ при РП, направленный на выявление и характеристику диагностических и прогностических маркеров заболевания.

Задачи исследования:

1. Изучить мутации, аллельные делеции и метилирование промотора гена VHL и провести сравнительный анализ выявленных изменений относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.

2. Провести анализ потери гетерозиготности областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и TP53 в парных образцах РП на различных стадиях заболевания и степенях дифференцировки первичной опухоли.

3. Оценить частоты аберрантного метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в образцах РП и провести сравнительный анализ метилирования этих генов относительно патологических параметров первичной опухоли и клинических особенностей заболевания.

4. Исследовать метилирование CpG-динуклеотидов в промоторной области гена HOXB13, построить карту аберрантного метилирования этого гена.

5. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов ABCB1, TGFBR1, IL10, VDR в норме и у больных РП. Провести сравнительный анализ полученных данных между группами пациентов и контроля, а также между различными клиническими группами больных РП.

Научная новизна. Идентифицированы 33 новые мутации в гене VHL. Впервые исследованы сочетанные делеции генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при СРП. Изучено метилирование 5‘-регуляторных областей генов VHL, RASSF1 , FHIT, SFRP1 и CDH1 с помощью мультилокусной метилчувствительной ПЦР. Впервые показана ассоциация аберрантного метилирования RASSF1 с прогрессией первичной опухоли на ранних стадиях РП (Р = 0.047). С помощью бисульфитного секвенирования построена карта метилирования промотора гена-кандидата HOXB13 в первичных опухолях почки. С помощью нового метода - минисеквенирования с детекцией в режиме фрагментного анализа - изучены полиморфные варианты генов ABCB1, TGFBR1 , IL10 и VDR. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP генов IL10 и TGFBR1, получены данные о возможном влиянии полиморфизмов в генах VDR и TGFBR1 на развитие опухолей почки.

Практическая значимость. Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 127 первичных опухолей почки (светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином). Оптимизирован метод комплексной оценки молекулярно-генетических нарушений VHL (соматических мутаций, аберрантного метилирования и потери гетерозиготности) при СРП. Выявлена высокая частота повреждений гена VHL при СРП. Разработаны системы из двух STR-маркеров для тестирования аллельных делеций в областях локализации генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при РП. Определена ассоциация множественных аллельных делеций генов-супрессоров на 3р (Р = 0.036), а также метилирования генов RASSF1 и CDH1 с клинико-морфологическими характеристиками опухоли (Р = 0.001), что позволит использовать анализ этих генов в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях РП. Результаты, полученные в представленной работе, могут быть использованы в разработке системы молекулярно-генетических маркеров РП, в частности, определение мутаций и метилирования гена VHL - при оптимизации таргетной терапии. Положения, выносимые на защиту:

1. Мутации, потеря гетерозиготности и/или метилирование гена VHL происходят на ранних стадиях СРП в большинстве случаев заболевания.

2. Потеря гетерозиготности двух и более генов-супрессоров, локализованных в области 3р, отражает прогрессию первичной опухоли.

3. Аберрантное метилирование является существенным механизмом инактивации генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и наблюдается в 85% первичных почечно-клеточных карцином. Построена карта метилирования промотора гена-кандидата HOXB13 при спорадическом РП.

4. Метилирование генов RASSF1 и CDH1 ассоциировано с прогрессией и метастазированием первичной опухоли, соответственно, что позволяет рассматривать их как составную часть системы молекулярных маркеров РП.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все эксперименты и методики были разработаны и проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007-2008 гг., на конгрессах Российского общества онкоурологов в 2006-2007 гг., на Российском онкологическом конгрессе в 2007 г., конференции «Генетика в России и в мире» в 2006 г., конференции по биологии и генетике в 2007 г., конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 г., а также на межлабораторных семинарах ГУ МГНЦ РАМН. Прочитана лекция на кафедре генетики Факультета усовершенствования врачей Российского государственного медицинского университета Росздрава.

Публикации. Результаты диссертационной работы отражены в 14 печатных работах соискателя, в том числе, 6 статей опубликовано в журналах,рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику. На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при светлоклеточном раке почки» и «Молекулярно-генетическая методика оптимизации таргетной терапии при светлоклеточном раке почки» (Разрешения на применение новой медицинской технологии ФС № 2008/150 от 22.07.2008 и ФС № 2008/152 от 23.07.2008, соответственно). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в Межклинической лаборатории молекулярных методов диагностики ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова: анализ терминальных мутаций в гене VHL при диагностики синдрома Хиппеля-Линдау, определение аллельных делеций генов-супрессоров в области 3р при спорадическом РП.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 18 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Образцы опухолей почки предоставлены Урологической клиникой им. Р.М. Фронштейна ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, ГУ МРНЦ РАМН и ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена (всего 127 образцов РП). Все случаи РП классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1997 г.). Из них 53% (67/127) соответствовали I стадии заболевания, 12% (15/127) - II, 21% (27/127) - III и 14% (18/127) - IV. На момент постановки диагноза 17% (21/127) пациентов в изучаемой выборке имели метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы.

Геномную ДНК из замороженных образцов опухолей и соответствующих им участков гистологически не измененной ткани выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией. Архивные образцы опухолей, заключенные в парафиновые блоки, предварительно депарафинизировали с помощью ксилола и этанола.

Мутации VHL выявляли с помощью ПЦР экзонов 1-3, SSCP-анализа ПЦР-продуктов и последующего секвенирования. При анализе ДНК, полученной из парафиновых блоков, амплифицировали 3‘-часть 1-го экзона.

Для анализа потери гетерозиготности (ПГ) генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 была разработана оригинальная система из STR-маркеров (по два микросателлитных локуса на каждый ген): D3S1317 и D3S1038 (VHL), D3S1568 и D3S966 (RASSF1), D3S1234 и D3S1300 (FHIT), D17S1353 и IVS1 (TP53). Проводили ПЦР вариабельных локусов, затем ПЦР-продукты разделяли в 10% денатурирующем ПААГ (IVS1-TP53 - в 8% ПААГ).

Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 определяли с помощью метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР). Дизайн праймеров осуществлен в настоящем исследовании с помощью программ PerlPrimer и Vector NTI. Предварительно проводили обработку геномной ДНК метилчувствительной рестриктазой BstHHI («СибЭнзим», Новосибирск).

При подготовке к бисульфитному секвенированию геномную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который вызывает переход неметилированных остатков цитозина в урацил, но не изменяет метилированные цитозины. Дизайн метилспецифических праймеров был выполнен с помощью интерактивной программы MethPrimer.

ПЦР-продукты, предназначенные для секвенирования, подвергали электрофорезу в 1%-ом агарозном геле, затем эллюировали с помощью колонок Quantum Prep® Freeze‘N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns («Bio-Rad Laboratories»). Секвенирование проводили с использованием BigDye® Terminator v 3.1. Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI3100 в соответствиями с протоколами фирмы «Applied Biosystems».

Мультилокусную ПЦР полиморфизмов ABCB1, TGFBR1, IL10, VDR проводили с использованием праймеров, фланкирующих исследуемые SNP в каждом из генов (методика разработана в ходе настоящей работы). Не вошедшие в реакцию праймеры и dNTP инактивировали экзонуклеазой I из E.coli и щелочной фосфатазой ("Fermentas", Литва). Далее к ПЦР-продуктам добавляли внутренние праймеры для каждого SNP и проводили реакцию с использованием ABI Prism® SNaPshot^TM Multiplex Kit ("Applied Biosystems"), затем проводили обработку продуктов реакции щелочной фосфатазой. Детекцию проводили на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 ("Applied Biosystems").

Статистический анализ частот аллелей и генотипов полиморфизмов, метилирования и ПГ проводили с помощью точного двустороннего критерия Фишера. Комплексный анализ встречаемости генетических нарушений в нескольких группах осуществляли при использовании критерия % .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Изучение инактивации гена VHL при спорадическом раке почки

Инактивация гена VHL вследствие молекулярно-генетических нарушений выявляется в большинстве светлоклеточных карцином почки, при этом влияние инактивирующих событий на развитие опухоли неоднозначно. В настоящей работе определяли мутации (рис. 1), аллельные делеции и метилирование как причины инактивации VHL. Мутации VHL были определены в 31.7% (39/123) СРП. Все выявленные мутации соматические, что, наряду с клиническими данными, позволило исключить синдром Хиппеля-Линдау и рассматривать имеющиеся образцы как выборку спорадического СРП. Среди мутаций 69.2% (27/39) составляли делеции, протяженность которых варьировала от 1 до 42 п.н., 18.0% (6/39) - инсерции, дупликации и комплексная мутация, оставшиеся 12.8% (5/39) приходятся на однонуклеотидные замены. Впервые идентифицированные мутации определены в 84.6% (33/39) образцов СРП.

Большинство делеций и инсерций, а также дупликации и комплексная мутация, составляющие 56.4% (22/39), приводили к сдвигу рамки считывания и формированию новых стоп-кодонов.

Рисунок 1. Определение мутации c.472C-G. Вверху - результат SSCP-анализа экзона 3 гена VHL (N и Т - нормальная и опухолевая ткани, соответственно), ПЦР-продукт с аномальной подвижностью в образце 5Т; секвенирование ПЦР-продукта 5Т с обратного праймера, идентификация мутации.

Аллельные делеции VHL при СРП определяли по STR-маркерам D3S1317 и D3S1038. Проанализированы 94 образца замороженных тканей опухолей и соответствующих им образцов нормальной почечной паренхимы, взятых на расстоянии не менее 1.5 см от края новообразования. Информативность используемых микросателлитных локусов составила 47.9% (45/94) для D3S1317 и 77.7% (73/94) - для D3S1038. Система из двух STR-маркеров позволяла определять аллельные делеции в 91.5% (86/94) случаев. ПГ обнаружена в 27.9% (24/86) информативных образцов СРП.

Метилирование промотора VHL исследовали с помощью МЧ-ПЦР (рис. 2). Исследовали 94 парных образца тканей опухолей и почечной паренхимы, а также 29 парафиновых блоков с архивными образцами СРП (всего 123 опухоли). Метилирование промотора гена определено только в образцах СРП и не выявлено в гистологически нормальной ткани. Частота аберрантного метилирования составила 14.6% (18/123) выборки СРП.

Рисунок 2. Анализ метилирования VHL. М - маркер молекулярной массы (pUC19/MspI, размеры фрагментов в п.н. указаны слева), ОК - отрицательный контроль амплификации, ПК - положительный контроль амплификации, К+ - внутренний контроль ПЦР (экзон 2 гена VHL), МЕТ - анализируемый участок промотора VHL, 1-12 - анализируемые образцы опухолей. Аберрантное метилирование выявлено в образцах 5 и 10.

Сопоставлены участки CpG-островка, анализируемого в представленной работе и у других авторов. Показано, что все праймеры для метилспецифической ПЦР (МС-ПЦР) в других исследованиях локализованы внутри участка, изученного в настоящей работе. Один из праймеров всегда содержал CpG-динуклеотиды в позициях -162, -164 и -168, два из которых (-162 и -168) входят в сайты узнавания метилчувствительной рестриктазы BstHHI. Методом МС-ПЦР изучали метилирование 8 остатков цитозина в области с.-24_-168. В настоящей работе проведен анализ метилирования с помощью МЧ-ПЦР семи CpG-динуклеотидов на том же участке. Таким образом, МЧ- и МС-ПЦР могут служить альтернативными методами определения метилирования промотора VHL.

У больных на I стадии СРП соматические мутации в гене VHL выявлены в 35.4% (23/65) случаев, ПГ - в 28.2% (11/39) информативных случаев и аберрантное метилирование - в 20.0% (13/65) образцов. В целом, хотя бы одно из нарушений гена VHL обнаружено у 53.8% (35/65) больных с I стадией заболевания, что свидетельствует в пользу инактивации VHL на ранних стадиях СРП.

Следует отметить, что инактивация VHL влияет не только на развитие первичной опухоли, но и может определять тактику лечения СРП. В последние 3 года в лечении метастатического СРП произошли существенные изменения, и в настоящее время это заболевание можно считать одним из наиболее удачных примеров применения таргетных препаратов. Эти препараты представляют собой ингибиторы определенных тирозинкиназ или факторов роста, которые взаимодействуют лишь с определенными молекулами, играющими ключевую роль в развитии РП. Наиболее эффективные из них - Сутент и Нексавар, ключевые мишени которых (VEGFR 1-го и 2-го типов, PDGFR) гиперэкспрессируются в ответ на инактивацию VHL. Следовательно, СРП, несущий молекулярно-генетические нарушения VHL, может представлять собой наиболее оптимальный случай для терапии одним из этих препаратов. Выдвинутое предположение нашло подтверждение в первом исследовании, показавшем более выраженный эффект применения Сутента у пациентов с соматическими мутациями VHL, чем у пациентов без мутаций [Личиницер М.Р., 2007].

Таким образом, соматические мутации, ПГ и аберрантное метилирование промотора VHL могут рассматриваться как перспективные маркеры СРП. Указанные молекулярно-генетические нарушения присутствуют в первичной опухоли на ранних стадиях заболевания и влияют на чувствительность опухоли к таргетным препаратам.

Исследование аллельных делеций генов VHL, RASSF1, FHIT и TP53

Помимо VHL, для СРП характерны аллельные делеции других генов-супрессоров, которые могут оказывать влияние на развитие злокачественного новообразования. Для определения прогностической значимости аллельных делеций в настоящем исследовании определена ПГ областей локализации генов VHL, RASSF1, FHIT (гены-супрессоры в области 3p) и ТР53 (рис. 3). А 1Т 1Ы 2Т 2N ЗТ ЗЫ Б 4Ы 4Т 5N 5Т БЫ GT

Рисунок 3. Выявление ПГ. А - результат электрофореза в 8% ПААГ пентануклеотидного повтора IVS1 гена ТР53 (T и N - опухолевая и нормальная ткани, соответственно), 1 -гомозигота, 2 - ПГ в опухолевой ткани, 3 - нормальная гетерозигота; В - результат денатурирующего электрофореза в ПААГ микросателлита D3S1568 (образцы нанесены на гель в обратном порядке), 4 - гомозигота, 5 - ПГ в опухолевой ткани (область гена RASSF1), 6 - нормальная гетерозигота.

Информативность STR-локуса D3S1568 составила 58.5% (55/94), D3S966 -62.8% (59/94), D3S1300 - 67.0% (63/94), D3S1234 - 85.1% (80/94), D17S1353 -67.0% (63/94) и IVS1 - 61.7% (58/94), информативность и характеристики систем из двух STR-маркеров для VHL указаны в предыдущем разделе. Системы из двух вариабельных локусов позволяли определять ПГ гена RASSF1 в 85.1% (80/94), FHIT - 95.7% (90/94) и TP53 - 89.4% (84/94) случаев.

ПГ гена RASSF1 обнаружена в 27.5% (22/80), FHIT - 35.6% (32/90), TP53 -17.9% (15/84) и, как упоминалось ранее, VHL - 27.9% (24/86) информативных образцов СРП. Аллельные делеции хотя бы одного гена на 3р наблюдали в 56.4% (53/94), а в совокупности из четырех исследованных генов - в 60.6% (57/94) информативных случаев.

N = 94	RASSF1 (N* = 80)		FHIT (N* = 90)		TP53 (N* = 84)		> 2 гена на 3p (N* = 91)
	частота	Р	частота	Р	частота	Р	частота	Р
Si-ii	21.3% (10/47)	0.203	30.2% (16/53)	0.264	18.0% (9/50)	0.999	14.8% (8/54)	0.116
Siii-iv	36.4% (12/33)	0.203	43.2% (16/37)	0.264	17.6% (6/34)	0.999	29.7% (11/37)	0.116
G1-2	23.6% (13/55)	0.287	34.4% (21/61)	0.815	16.4% (9/55)	0.766	16.4% (10/61)	0.172
G3-4	36.0% (9/25)	0.287	37.9% (11/29)	0.815	20.7% (6/29)	0.766	30.0% (9/30)	0.172
T1-2	22.9% (11/48)	0.311	30.9% (17/55)	0.267	17.6% (9/51)	0.999	16.1% (9/56)	0.189
T3-4	34.4% (11/32)	0.311	42.9% (15/35)	0.267	18.2% (6/33)	0.999	28.6% (10/35)	0.189
ТхNoMo	24.2% (16/66)	0.192	31.5% (23/73)	0.158	18.6% (13/70)	0.999	16.0% (12/75)	0.036
N и/или М полож.	42.9% (6/14)	0.192	52.9% (9/17)	0.158	14.3% (2/14)	0.999	43.8% (7/16)	0.036

Таблица 1. ПГ генов-супрессоров в различных клинических группах (результаты по VHL приведены в тексте ранее). N - объем выборки СРП, N* - количество информативных случаев для каждого из исследуемых генов, S - стадия заболевания, G - степень дифференцировки первичной опухоли, T - размер первичной опухоли по TNM-классификации, N - метастазы в регионарных лимфоузлах, М - отдаленные метастазы.

Выявлена ассоциация аллельных делеций по двум и более генам-супрессорам, локализованным на коротком плече хромосомы 3, с наличием метастазов на момент постановки диагноза: Р = 0.036, OR = 1.49 (95% CI: 1.012.33). Можно предположить, что ПГ нескольких генов-супрессоров на 3р связана с опухолевой прогрессией, в отличие от аллельных делеций одного из исследованных генов в области 3р или гена ТР53 (табл. 1).

Следует отметить, что в последнее время много внимания уделяют комплексным исследованиям аллельного дисбаланса (ПГ и амплификации), экспрессионному профилю генов в зонах аллельного дисбаланса и соотнесению выявленных изменений с клинико-патологическими характеристиками опухоли. Выявленная в настоящей работе ассоциация множественных аллельных делеций с метастазированием первичной опухоли может быть учтена при выборе прогностических критериев спорадического СРП. Изучение метилирования генов-супрессоров VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в опухолях почки

В настоящем исследовании изучено метилирование 5‘-регуляторных областей генов-супрессоров, локализованных в области 3р (VHL, RASSF1 и FHIT), а также генов SFRP1 и CDH1. Метилирование определено МЧ-ПЦР (рис. 3). Исследованы 98 парных образцов светлоклеточных, папиллярных и хромофобных карцином, 29 парафиновых блоков СРП. В образцах гистологически не измененной почечной парнехимы гиперметилирование генов-супрессоров не выявлено.

В опухолях аберрантное метилирование VHL определено в 14.2% (18/127), RASSF1 - 52.8% (67/127), FHIT - 54.3% (69/127), SFRP1 - 33.1% (42/127) и CDH1 - 41.7% (53/127) случаев. Результаты, полученные методом МЧ-ПЦР, подтверждены бисульфитным секвенированием гиперметилированных образцов. В более редких, чем СРП, типах РП были метилированы гены: RASSF1 - в 1 из 2 папиллярных карцином, FHIT - в 1 из 2 папиллярных и в 1 из 2 хромофобных карцином. Метилирование двух указанных генов можно рассматривать как распространенное событие в канцерогенезе опухолей почки.

В настоящем исследовании наблюдаемая частота метилирования гена SFRP1 отличалась от данных, опубликованных ранее (33% против 68%) [Dahl E., 2007]. Это может быть объяснено различными методическими подходами в анализе CpG-островка и репрезентативностью выборок (123 светлоклеточных карциномы в настоящем исследовании и 38 - у других авторов). Частота метилирования другого исследованного в этой работе гена - CDH1 - близка к данным литературы [Costa V.L., 2007]. Проведен сравнительный анализ частот метилирования в парных клинических группах в зависимости от стадии заболевания, степени дифференцировки первичной опухоли и метастазирования (табл. 2). Показана ассоциация метилирования CDH1 с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024, OR = 2.40 95% CI: 1.13-5.08) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001, OR = 5.98 95% CI: 2.03-17.59). Продукт гена CDH1, Е-кадгерин, участвует в обеспечении контактного торможения пролиферации в эпителиальных тканях, в том числе, в эпителии почечных канальцев. Инактивацию гена CDH1 вследствие метилирования можно рассматривать как событие, способствующее инвазивному росту и метастазированию первичной опухоли. Анализ аберрантного метилирования CDH1 на сегодняшний день представляется одним из перспективных прогностических маркеров РП, чему соответствуют результаты настоящего исследования.

Помимо молекулярно-генетических изменений, характеризующих инвазию и метастазирование, не меньший интерес вызывают потенциальные маркеры прогрессии опухоли, которые могут быть выявлены на ранних стадиях заболевания. В работе выбраны гены-кандидаты с наибольшей абсолютной частотой метилирования (>40 образцов) на ранних стадиях РП - гены RASSF1 и FHIT. Показано, что метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047, OR = 2.58, 95% CI: 1.04-6.35). Можно предположить, что метилирование VHL, RASSF1, FHIT и SFRP1 встречается в значительной доле случаев РП уже на первой стадии, тогда как с прогрессией первичной опухоли ассоциировано аберрантное метилирование RASSF1, которое может считаться потенциальным неблагоприятным маркером на ранних стадиях РП.

Ген	Si-п : Sih-iv 82 : 45	Ps	G1-2 : G3-4 89 : 38	Pg	T1-2 : T3-4 84 : 43	Pt	М- : М+ 106 : 21	Pm
VHL	14 : 4	0.289	14 : 4	0.582	15 : 3	0.113	16 : 2	0.735
RASSF1	38 : 29	0.064	45 : 22	0.561	41 : 26	0.261	52 : 15	0.093
FHIT	46 : 23	0.710	47 : 22	0.698	47 : 22	0.707	55 : 14	0.240
SFRP1	22 : 20	0.051	25 : 17	0.100	23 : 19	0.073	32 : 10	0.134
CDH1	29 : 24	0.061	33 : 20	0.119	29 : 24	0.024	37 : 16	0.001

Таблица 2. Метилирование генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1 в парных клинических группах (указаны абсолютные частоты нарушений в каждой из групп). S - стадии заболевания, G - степень дифференцировки первичной опухоли, Т - размер первичной опухоли по TNM-классификации, М - метастазы в регионарных лимфатических узлах и/или отдаленные метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп). Р_Т> Р_м> -вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп.

Несмотря на то, что у большинства пациентов РП выявляют на стадии локализованного опухолевого процесса, в 20% случаев заболевание характеризуется как местнораспространенное. Основной метод лечения локализованного РП - хирургический, который может дополняться адьювантной неспецифической иммунотерапией препаратами ИЛ-2 и ИФН-а в случае местнораспространенного СРП с учетом соматического статуса пациента, в связи с чем особенно актуальным вопросом является оценка прогрессии первичной опухоли [Wood C.G., 2007]. Можно предположить, что исследование ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT, и метилирования гена CDH1 может быть использовано вместе с другими необходимыми тестами при назначении адьювантной иммунотерапии после удаления первичной опухоли при местнораспространенном СРП.

В настоящее время анализ метилирования становится особенно актуальным в связи с поиском маркеров РП, выявляемых в биологических жидкостях пациента. Фрагменты ДНК опухолевых клеток попадают в кровоток, и аберрантное метилирование, специфичное для опухоли, может быть выявлено с помощью ПЦР в плазме (сыворотке) крови. Также описаны успешные примеры обнаружения аберрантного метилирования генов-супрессоров в моче пациентов. Однако применяемые методологические подходы нуждаются в повышении диагностической и аналитической чувствительности, а панели тестируемых генов - в пополнении новыми генами-кандидатами. Частота аберрантного метилирования исследованных в настоящей работе генов вариьровала от 14.2 до 54.3%. Метилирование как минимум одного из исследованных генов обнаружено в 85.0% (108/127) образцов. При объединении генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1 и CDH1, изученных в настоящей работе, с такими генами как CDKN2A, RARB2, PTGS2, CTNNB1, представляется возможным сформировать систему маркеров метилирования с чувствительностью более 95%. Это будет способствовать развитию неинвазивной высокоинформативной диагностики РП.

Метилирование гена HOXB13 при спорадическом раке почки

Среди новых генов-супрессоров, которые могут быть метилированы при РП, привлекает внимание ген HOXB13, участвующий в развитии и дифференцировке органов мочеполовой системы [Okuda H., 2006]. В настоящей работе проведено бисульфитное секвенирование промотора гена HOXB13 в 5 образцах СРП и соответствующих им образцах гистологически не измененной ткани (рис. 4).

Показано, что в опухолях подвергаются аберрантному гиперметилированию цитозины в составе CpG-динуклеотидов, преимущественно, в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG. Можно предположить, что анализ этих четырех CpG-динуклеотидов позволит достоверно оценивать метилирование промотора HOXB13 в опухолях почки.

Рисунок 4. Бисульфитное секвенирование промотора гена HOXB13 (N - позиции аберрантно метилированных цитозинов, указаны стрелками).

Анализ полиморфных вариантов генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR

Предрасположенность к РП может быть обусловлена аллельными вариантами ряда генов, участвующих в регуляции клеточного цикла, метаболизме ксенобиотиков и противоопухолевом иммунитете. Для настоящего исследования предрасположенности к РП были выбраны SNP в четырех генах -ABCB1 (C3435T), TGFBR1 (int7G24A), IL10 (G-1082A) и VDR (Taq1). Сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах контроля и больных РП, а также в различных клинических группах пациентов, в том числе, в многофакторном анализе. Полиморфизмы анализировали с помощью минисеквенирования (рис. 5).

&г i-_T_Ci X J _ С Ci S

SO SO

A A

&г »-_r_Ci X Ci _T£ Ci <П

А А А. ДА к

JT1L J. О

SO SO

Л. Л AA 1A

Рисунок 5. Определение полиморфизмов в генах ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR методом минисеквенирования. Показаны три образца, позиции аллелей обозначены внизу. Генотипы ABCB1-TGFBR1-IL10- VDR: 1 (TC-GA-AG-TC), 2 (TC-GG-AG-CC), 3 (TC-GA-AA-TC).

В качестве популяционного контроля исследовали 151 образец ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови здоровых индивидуумов. Выборка пациентов с РП составила 98 человек, исследовали ДНК, выделенную из участков нормальной почечной паренхимы. Впервые в России определены в норме частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1: 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А); IL10: 51% (A/G), 32% (A/A) и 17% (G/G) .

Генотип	Si-ii : Siii-iv 59 : 39	Ре	G1-2 : G3-4 66 : 32		М- : М+ 83 : 15	Рм
ABCB1-TC	27 : 23	0.360	36 : 14	0.338	43 : 7	0.852
ABCB1-TT	23 : 10	Т: 0.999	19 : 14	Т: 0.768	27 : 6	Т: 0.999
		С: 0.196		С: 0.174		С: 0.567
ABCB1-CC	9 : 6	С: 0.196	11 : 4	С: 0.174	13 : 2	С: 0.567
TGFBR1-GG	34 : 30	0.086	39 : 25	0.115	50 : 14	0.046
TGFBR1-GA	23 : 7	G: 0.999	23 : 7	G: 0.300	29 : 1	G: 0.999
		A: 0.055		A: 0.074		A: 0.016
TGFBR1-AA	2 : 2	A: 0.055	4 : 0	A: 0.074	4 : 0	A: 0.016
IL10-AG	28 : 19	0.427	32 : 15	0.474	37 : 10	0.204
IL10-AA	16 : 14	A: 0.317	22 : 8	A: 0.299	26 : 4	A: 0.180
		G: 0.379		G: 0.487		G: 0.999
IL10-GG	15 : 6	G: 0.379	12 : 9	G: 0.487	20 : 1	G: 0.999
VDR-TT	22 : 15	0.945	24 : 13	0.537	30 : 7	0.718
VDR-TC	33 : 22	Т: 0.999	39 : 16	Т: 0.389	48 : 7	Т: 0.999
VDR-CC	4 : 2	С: 0.999	3 : 3	С: 0.825	5 : 1	С: 0.564

Таблица 3. Полиморфные варианты генов ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR в различных клинических группах. Обозначения: S - стадии заболевания, G - степень дифференцировки первичной опухоли, М - метастазы (рядом указано количество случаев в каждой из групп).

Ра Рм, - вероятности нулевой гипотезы при сравнении соответствующих парных групп, в ячейках сверху указана Р при сравнении частот генотипов, ниже - Р при сравнении частот встречаемости определенных аллелей.

Выявлены достоверные различия частот генотипов VDR при РП относительно контроля (Р = 0.025). В группе РП наблюдалась тенденция к увеличению частоты встречаемости аллеля Т и снижению - аллеля С (генотипа С/С - почти в 1.85 раза). Возможно, снижение частоты протективного аллеля С и/или генотипа С/С связано с предрасположенностью к развитию РП в исследуемой популяции. Недавно опубликованы данные, подтверждающие протективную роль аллеля С в популяциях центральной и восточной Европы при наличии фактора риска - онкологических заболеваний у родственников [Karami S., 2008]. Показано, что частота аллеля А гена TGFBR1 снижена у пациентов с регионарными и/или отдаленными метастазами Р = 0.012, OR = 0.804 (95% CI: 0.724-0.893). Достоверно уменьшена в группе больных с метастазами и частота встречаемости этого аллеля в составе гомо- и гетерозиготных носителей (табл. 3). Полученные результаты способствуют формированию системы прогностических маркеров для спорадического РП.

Настоящая работа представляет собой комплексное исследование инактивации гена VHL, ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT и ТР53, аберрантного метилирования генов VHL, RASSF1, FHIT, SFRP1, CDH1 и HOXB13, а также полиморфизмов в генах ABCB1, TGFBR1, IL10 и VDR при РП. Проведен сравнительный анализ выявленных в первичных опухолях молекулярно-генетических нарушений между группами пациентов, которые были сформированы в зависимости от стадии заболевания, наличия метастазов, степени дифференцировки первичной опухоли. Нарушения в гене VHL выявлены у 54% пациентов на I стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Следует отметить, что определение мутаций и метилирования VHL целесообразно использовать при оптимизации таргетной терапии у больных метастатическим СРП. Получены результаты, указывающие на возможность использования метилирования CDH1 и ПГ генов-супрессоров на 3р в качестве прогностических маркеров спорадического РП. Построена карта метилирования нового гена-супрессора HOXB13. Выявлена ассоциация полиморфных вариантов VDR и TGFBR1 с развитием заболевания.

Поиск и характеристика молекулярно-генетических маркеров, выполненные в настоящем исследовании, вместе с изучением потенциальных иммуногистохимических и биохимических особенностей почечно-клеточных карцином, позволят сформировать систему диагностических и прогностических маркеров РП. На сегодняшний день, проведение молекулярно-генетических исследований, направленных на поиск маркеров злокачественных новообразований, представляет собой одну из приоритетных задач молекулярной медицины.

ВЫВОДЫ

1. Соматические мутации, потеря гетерозиготности и метилирование гена VHL выявлены у 54% пациентов на первой стадии СРП, что указывает на раннюю инактивацию VHL при этом заболевании. Впервые идентифицированы 33 новые мутации VHL.

2. Аллельные делеции двух и более генов-супрессоров (VHL, RASSF1, FHIT), локализованных на коротком плече хромосомы 3, ассоциированы с наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.036), что может отражать прогрессию первичной опухоли.

3. Аберрантное метилирование 5‘-регуляторных областей гена VHL составляет

14%, RASSF1 - 53%, FHIT - 54%, SFRP1 - 33% и CDH1 - 42% случаев РП.

Метилирование хотя бы одного из исследованных генов происходит в 85% случаев рака почки. Метилирование CDH1 ассоциировано с прорастанием опухолью капсулы почки (Р = 0.024) и наличием метастазов на момент постановки диагноза (Р = 0.001). Метилирование RASSF1 чаще встречается в умеренно-, чем в высокодифференцированных первичных опухолях (Р = 0.047). Метилирование RASSF1 и CDH1 может служить в качестве неблагоприятного прогностического маркера на различных стадиях РП.

4. Построена карта метилирования CpG-островка гена HOXB13 при СРП. Аберрантному метилированию, преимущественно, подвергаются цитозины в позициях -139, -160, -176 и -178 от стартового кодона ATG, что может быть использовано при определении частоты метилирования HOXB13 в опухолях почки.

5. Частоты генотипов исследуемых SNP гена TGFBR1 в норме составляют 56% (G/G), 40% (G/A) и 4% (А/А); IL10 - 51% (A/G), 32% (A/A) и 17% (G/G). Частоты генотипов VDR при РП достоверно отличаются от контроля (Р = 0.025). У больных РП с метастазами уменьшена частота встречаемости

аллеля А гена TGFBR1 (Р = 0.016).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ В настоящей работе получены данные об инактивации гена VHL на различных стадиях рака почки, выявлены ассоциации множественных аллельных делеций генов-супрессоров в области 3р и метилирования генов RASSF1 и CDH1 с прогрессией первичной опухоли, причем аберрантное метилирование как минимум одного из исследованных генов наблюдалось в 85% случаев рака почки. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными из литературных источников позволили предложить практические рекомендации по использованию некоторых результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике:

1. Определение потери гетерозиготности генов VHL, RASSF1 и FHIT вместе с исследованием метилирования промоторной области CDH1 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием при оценке прогноза РП.

2. Исследование соматических мутаций и метилирования гена VHL как комбинированный молекулярно-генетический анализ рекомендуется осуществлять для оптимизации таргетной терапии СРП при использовании мультикиназных ингибиторов, связанных с патогенетическим путем инактивации VHL.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Д.С. Михайленко, М.В. Немцова. Молекулярно-генетические маркеры рака почки // Российский онкологический журнал. - 2007. - № 4. - С.48-

51.

2. Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, О.Б. Карякин, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, М.В. Немцова, Д.В. Залетаев. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки // Молекулярная биология. - 2008. - Т.42. - №1. - С.71-77.

3. Михайленко Д.С., Попов А.М., Курынин Р.В., Аляев Ю.Г., Завалишина Л.Э., Залетаев Д.В. Анализ молекулярно-генетических нарушений в генах VHL, RASSF1, FHIT и ТР53 при светлоклеточном раке почки // Медицинская генетика. - 2008. - № 4. - С. 9-14.

4. Залетаев Д.В., Немцова М.В., Стрельников В.В., Бабенко О.В., Пальцева Е.М., Землякова В.В., Кузнецова Е.Б., Кекеева Т.В., Михайленко Д.С., Манохина И.К. Эпигенетические маркеры в диагностике онкозаболеваний // Молекулярная медицина. - 2008. - №4. - С.46-51.

5. Курынин Р.В., Михайленко Д.С., Залетаев Д.В., Аляев Ю.Г. Молекулярные маркеры в диагностике и лечении рака почки // Молекулярная медицина. - 2008. - №4. - С.24-28.

6. М.В. Немцова, Д.С. Михайленко, Т.В. Кекеева, О.А. Кузнецова, С.В. Башкатов, Р.В. Курынин, А.М. Попов, О.П. Попова, П.В. Шегай, Ю.Ю. Андреева, Б.Я. Алексеев, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, О.Б. Карякин, И.Г. Русаков, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Молекулярно-генетические маркеры в онкоурологии // Молекулярная медицина. - 2007. - №3. - С.43-54.

7. Д.С. Михайленко, А.М. Попов, Р.В. Курынин, О.Б. Карякин, К.Н. Сафиуллин, Е.Ф. Лушников, С.Д. Фомин, Ю.Г. Аляев, В.А. Григорян, М.Э. Еникеев, Д.В. Залетаев. Структурно-функциональные изменения генов-супрессоров короткого плеча хромосомы 3 при спорадическом светлоклеточном раке почки // Тезисы I-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва, Россия. - 2006. - С.150.

8. Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов А.М., Еникеев М.Э., Григорян

B. А., Аляев Ю.Г., Карякин О.Б., Залетаев Д.В. Изучение потерь гетерозиготности в областях локализаций генов VHL, RASSF1 и FHIT при светлоклеточном раке почки // Сборник тезисов международной конференции «Генетика в России и в мире», Москва, Россия. - 2006. -

C. 126.

9. Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, О.Б. Карякин, Л.Э. Завалишина, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Поиск молекулярно-генетических маркеров светлоклеточного рака почки // Тезисы II-го конгресса Российского общества онкоурологов, Москва,

Россия. - 2007. - С.133.

10. Д.С. Михайленко, Р.В. Курынин, А.М. Попов, М.Э. Еникеев, Ю.Г. Аляев, О.Б. Карякин, Л.Э. Завалишина, Г.А. Франк, Д.В. Залетаев. Молекулярно-генетический анализ инактивации гена VHL при спорадическом

светлоклеточном раке почки // Тезисы XI-го Российского онкологического конгресса, Москва, Россия. - 2007. - С.226.

11. Михайленко Д.С. Поиск молекулярно-генетических маркеров прогрессии светлоклеточного рака почки. Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2008. - №6. - С.297.

12. D. Mikhaylenko, R. Kurynin, A. Popov, O. Karyakin, M. Enikeev, Y. Alayev, M. Nemtsova, D. Zaletayev. Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer. Abstract of European Human Genetics Conference, Nice, France // European Journal of Human Genetics. - 2007. - Vol.15. - Suppl.1. - P.173.

13. D.S. Mikhaylenko, R.V. Kurynin, A.M. Popov, D.V. Zaletayev. Molecular genetic aberrations of the genes VHL, RASSF1, FHIT in patients with renal cancer. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine // Abstract book. - 2007. - P.177.

14. D.S. Mikhaylenko, A.M. Popov, R.V. Kurynin, D.V. Zaletayev. Analysis of the molecular-genetic alterations in the genes VHL, RASSF1, and FHIT in clear cell renal carcinomas. Abstract of European Human Genetics Conference, Barcelona, Spain // European Journal of Human Genetics. - 2008. - Vol. 16. - Suppl.2. -

P.235.