Факторы апоптоза и пролиферации при раке почки.

Факторы апоптоза и пролиферации при раке почки.

О.Б. Лоран, Г.А. Франк, А.В. Серегин, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, А.А. Серегин, Н.А. Шустицкий.

‘Кафедра урологии и хирургической андрологии ГОУ ДПО РМАПО; ФГУМНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва_

Почечно-клеточный рак (ПКР) составляет около 3% онкологических заболеваний взрослого населения мира [1, 2]. Единственным эффективным методом лечения рака почки (РП) является хирурги­ческий. Но его возможности при диссеминирован-ном РП ограничены - прогноз у таких пациентов весьма неблагоприятен. Медиана выживаемости - 6-12 мес, 2-летняя выживаемость редко превышает 20%, а 5-летняя выживаемость, по данным разных авторов, колеблется от 1 до 10% [3-5].

РП резистентен к гормональной и химиотера­пии [6-12]. Лучевая терапия при лечении распро­страненного РП практически неэффективна. Ее применение оправдано при наличии костных мета­стазов для снижения болевого синдрома [13, 14].

Широко используемая иммунотерапия, осно­ванная на применении интерферона а и интерлей-кина-2, позволяет рассчитывать на положительный результат не более чем в 20% [15]. Обращает на себя внимание отсутствие единой прогностической сис­темы, позволяющей адекватно оценить возможные результаты лечения каждого пациента. Нет и досто­верных прогностических факторов, обладающих необходимой чувствительностью и специфично­стью, при выборе тактики лечения, что заставляет продолжать исследования в этом направлении. Применение классических прогностических факто­ров, таких как размер опухоли, стадия заболевания, степень дифференцировки опухолевых клеток, ос­новано на статистических данных и далеко не все­гда позволяет прогнозировать течение РП у кон­кретного пациента.

Исследования последних лет проливают свет на суть такого биологического явления, как апоп-тоз - программированная клеточная смерть. В регу­ляции механизма апоптоза принимает участие до­вольно большая группа молекул, экспрессируемых соответствующими генами. Имеются сообщения о прогностической значимости определения апопто-тической готовности и пролиферативной активно­сти клеток ПКР [16-19], однако результаты прове­денных исследований весьма противоречивы.

Цель работы - определить клиническое и про­гностическое значения экспрессии маркеров апоп-тоза и пролиферации при местно-распространен-ном и метастатическом РП.

Задачи исследования

1. Оценить экспрессию CD95, р53, Bcl-2, Bcl-X, Bax, Bak, PCNA и Her-2/neu в опухолевых клетках при иммуногистохимическом исследовании ткани удаленной почки по поводу местно-распространен-ного и метастатического рака.

2. Сопоставить изученные биологические хара­ктеристики РП с течением заболевания.

3. Сравнить степень экспрессии факторов апоптоза и пролиферации с результатами проводи­мой иммунотерапии.

4. Выявить зависимость результатов иммуноте­рапии от степени экспрессии про- и антиапоптоти-ческих факторов и пролиферативной активности опухолевых клеток.

Материалы и методы исследования

В основу настоящей работы положен анализ результатов обследования и лечения больных мест-но-распространенным и метастатическим РП, нахо­дившихся на обследовании и лечении в стационарах клиники урологии РМАПО на базе ГКБ им. С.П. Боткина, Московской городской онкологической больницы №62 и Московского городского онколо­гического диспансера №1 с 2005 по 2007 г.

В исследование были включены 66 пациентов: 44 (67±5,8%) мужчины и 22 (33±5,8%) женщины, средний возраст - 55,84 года (от 39 лет до 71 года), страдавших местно-распространенным (1-я группа,

Таблица 1.      Результаты исследования экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации у больных местно-распространенным и метастатическим РП

Критерий		Группа, №					Нет		Слабая							Умеренная				Выраженная       Достоверность, p
							экспрессии, %		экспрессия, %							экспрессия, %				экспрессия, %
P53	1							93,75		6,25							0				0			<0,01
	2							52,9		47,1							0				0
Bcl-2			1					68,75	31,25									0			0			>0,05
			2					58,8	41,2									0			0
Bcl-X				1				68,75			25						6,25				0			>0,05
				2				82,4			17,6						0				0
Bak	1					62,5								6,25			25				6,25					>0,05
	2					29,4								41,2			23,5				5,9
Bax	1					62,5							18,75				18,75						0	>0,05
	2					64,7							29,4				5,9						0
CD95				1		6,25								37,5		31,25						25			<0,05
				2		35,3								41,2		17,6						5,9
PCNA				1 2	0 0							6,25 23,5			62,5 29,4				31,25 47,1							>0,05
Her-2				1 2	81,25 88,2							12,5 5,9			6,25 5,9				0 0							>0,05

Примечание. Здесь и в табл. 2: 1-я группа - местно-распространенный РП; 2-я группа - метастатический РП.

n=32) и метастатическим (2-я группа, n=34) ПКР. Всем пациентам была выполнена радикальная или циторедуктивная нефрэктомия. В послеоперацион­ном периоде всем больным проводилась иммуноте­рапия препаратами Роферон или Интрон А по схеме от 1 до 6 млн ЕД п/к ежедневно курсами по 10 инъ­екций с интервалом 2-3 нед. Терапию проводили до выявления прогрессирования болезни. Все больные проходили комплексное контрольное обследование через 3 и 6 мес после начала проведения иммуноте­рапии, далее - каждые полгода. Медиана наблюде­ния составила 9,8 мес (от 2 до 24 мес).

Для определения экспрессии изучаемых факто­ров мы использовали метод иммуногистохимиче-ского исследования с применением моноклональ-ных антител в следующих разведениях: Вах (1:1000), Вак (1:25), Fas (CD95) (1:50), Bcl-2 (1:70), Bcl-X (1:500), р53 (1:50), PCNA (1:300), Her-2/neu (1:300) производства фирмы DAKO (Дания). В качестве де-текционной системы была задействована полимер­ная система EnVision (DAKO).

Результаты

Первым этапом анализа результатов проведен­ного исследования было сравнение степени экс­прессии изучаемых маркеров апоптоза и пролифе­рации у пациентов в группах местно-распростра-ненного и метастатического РП (табл. 1).

При местно-распространенном РП экспрессия мутантного белка р53, отвечающего за остановку клеточного деления и регулирующего деятельность белков семейства Bcl-2, практически нам не встре­тилась. Из 32 пациентов этой группы экспрессия му-тантного р53 отмечена только у двух, что составило 6,25±4,3%. При метастатическом поражении почти в половине случаев выявлена экспрессия мутантно-го р53 (47,1±8,6%, р<0,01). При этом коэффициент корреляции экспрессии р53 со стадией заболевания достиг значимого уровня и составил 0,46. Получен­ные данные позволяют расценивать наличие экс­прессии мутантного р53 как фактор, отрицательно влияющий на прогноз заболевания и коррелирую­щий с наличием отдаленных метастазов.

При сравнении уровня экспрессии CD95 (FAS/Apo1) в изучаемых группах отмечено, что сре­ди пациентов с более ранней стадией РП, т.е. стади­ей местного распространения, достоверно чаще встречается активность данного фактора, чем у па­циентов с метастатическим поражением. В послед­нем случае возрастает доля клеток, не имеющих данный рецептор (6,25±4,3% в 1-й группе и 35,3+8,2% - во 2-й). Кроме того, снижается доля клеток с выраженной экспрессией CD95(FAS/Apo1) - 25+7,7% в 1-й группе и 5,9+4,0% - во 2-й (р<0,05). Модуль коэффициента корреляции оказался рав­ным 0,41, что позволило говорить о значимой корре­ляции. Таким образом, снижение уровня экспрес­сии CD95(FAS/Apo1) достоверно коррелирует с по­вышением стадии заболевания и наличием отдален­ных метастатических очагов.

Кроме того, при сравнительном анализе экс­прессии Bak в группах местно-распространенного и метастатического РП мы выявили достоверные раз­

Таблица 2.      Сравнение экспрессии изучаемых факторов

у пациентов обеих групп
Критерий	Группа, № Нет									Есть	Достоверность,
	экспрессии, %									экспрессия, %	p
P53			1 2		93,75 52,9			6,25 47,1				<0,01
Bcl-2			1 2		68,75 58,8			31,25 41,2				>0,05
Bcl-X				1		68,75			31,25					>0,05
				2		82,4			17,6
Bak		1					62,5		37,5				<0,01
		2					29,4		70,6
Bax		1					62,5		37,5				>0,05
		2					64,7		35,3
CD95				1			6,25	93,75						<0,01
				2			35,3	64,7
PCNA				1 2	0 0			100 100				>0,05
Her-2				1 2	81,25 88,2			18,75 11,8				>0,05

Таблица 3.      Характеристика пациентов по характеру прогрессии заболевания

Характер прогрессии

Местно-распрост раненный РП

Метастатический РП

локальный рецидив	4 (12,5)	6 (17,6)
Прогрессия   отдаленные метастазы	10 (31,3)	12 (37,5)     8 (23,5)      24 (70,6)
умерло	0 (0)	10 (29,4)

Примечание. Здесь и в табл. 4: в скобках - процент больных.

Таблица 4.      Сравнение экспрессии р53 у пациентов обеих групп

Показатель	Местно-	Метастатический РП
	распространенный РП
	Р53+ Р53-	Р53+ Р53-

Подгруппа прогрессии 0 (0)

Подгруппа стабилизации 2 (10)

Достоверность, p >0,05

личия, приняв за дискриминационный уровень на­личие его экспрессии в целом. В группе местно-рас-пространенного РП этот фактор отмечался реже (37,5+8,6%), чем в группе метастатического РП (70,6+7,8%, р<0,01). Коэффициент корреляции экс­прессии Bak со стадией заболевания составил 0,33, что соответствует значимому уровню и позволяет нам рассматривать факт наличия экспрессии в опухолевой клетке Bak как неблагоприятный фактор прогноза, ассоциирующийся с развитием метастатического по­ражения (табл. 2).

При анализе экспрессии ос­тальных исследуемых факторов

(Bcl-2, Bcl-X, Bax, Her-2/neu,PCNA) нами не было выявлено достоверных различий в группах пациентов со стадиями местного распространения и метастатиче­ского поражения. Наши резуль­таты позволили высказать мне­ние, что для обеих изучаемых ста­дий РП нехарактерны высокие уровни экспрессии белков семей­ства Bcl-2 и рецептора эпидер-мального фактора роста Her-2/neu. При этом необходимо от­метить, что экспрессия PCNA в клетках местно-распространен-ного и метастатического РП была достаточно высокой: в обеих группах преобладали клетки с умеренной и высокой пролифе-ративной активностью.

Вторым этапом нашего ис­следования была оценка разли­чия экспрессии изучаемых фак­торов в подгруппах пациентов по характеру течения заболевания и ответа на иммунотерапию. Ре­зультаты динамического наблю­дения за пациентами представле­ны в табл. 3.

При местно-распространен-ном и метастатическом РП раз­личие экспрессии мутантного р53 в подгруппах не носило достовер­ного характера (р>0,05), а коэф­фициент корреляции не достигал значимого уровня - 0,2 и 0,09 со­ответственно (табл. 4). Принимая во внимание полученные дан­ные, мы предполагаем, что, не­смотря на достоверные различия экспрессии этого фактора в клетках при местно-рас-пространенном и метастатическом РП, наличие му-тантного р53 не позволяет прогнозировать чувстви­тельность опухолевых клеток к иммунотерапии ин-терферонами. Имеющиеся различия в степени экс­прессии р53 между группами больных местно-рас-пространенным и метастатическим РП, возможно,

 

Таблица 6.      Результаты исследования белков семейства Bcl-2 у больных метастатическим РП

Показатель Характер течения		Нет экспрессии, %		Слабая экспрессия, %		Умеренная экспрессия, %		Выраженная экспрессия %		Достоверность,
Bcl-2 Прогрессия Эффект		58,3 60		41,7 40		0 0		0 0		>0,05
Bcl-X	Прогрессия Эффект		75 100		25 0		0 0		0 0		<0,05
Bak	Прогрессия Эффект		33,3 20		25 80		33,3 0		8,4 0		>0,05

Bax        Прогрессия       58,3 33,3 8,4 0 >0,05

Эффект 80 20 0 0

свидетельствуют лишь о наруше­нии функции этого белка на бо­лее поздних стадиях развития опухолевого процесса.

При оценке экспрессии се­мейства Bcl-2 в группе местно-распространенного РП нами не было выявлено достоверных от­личий в подгруппах прогрессиро-вания и стабилизации болезни по трем из четырех оцениваемых фа­кторов, а именно: Bcl-X, Bak и Bax (табл. 5). Однако в подгруппе прогрессирования экспрессия

Таблица 7.

Степень экспрессии, %Bcl-2 не определялась в 100% кле­ток, в то время как в подгруппе эффекта от проводимой терапии количество клеток с наличием и отсутствием экспрессии Bcl-2 было одинаковым - по 50% (р<0,05). Модуль коэффициента корреляции экспрессии Bcl-2 со­ставил 0,52, что позволило гово­рить о значимой связи между отсутствием в клетке Bcl-2 и прогрессией заболевания.

В случае метастатического РП нами выявлено достоверное различие только в экспрессии Bcl-X ме­жду подгруппами пациентов прогрессии РП и эффе­ктивной иммунотерапии (р<0,05). Bcl-X в подгруппе прогрессирования заболевания не обнаружен у 18 из 24 (75 + 8,8%) человек, был слабо выражен у 6 (25+8,8%). У всех пациентов подгруппы, ответив­ших на иммунотерапию, экспрессия Bcl-X не опре­делялась -10 человек - 100% (табл. 6). Между тем модуль коэффициента корреляции составил лишь 0,2, что не позволило говорить о значимой взаимо­связи между степенью экспрессии Bcl-X и эффектом терапии, хотя была выявлена тенденция влияния от­сутствия экспрессии Bcl-X на эффект иммунотера­пии при метастатическом РП. При анализе результа­тов иммуногистохимического исследования и сопо­

ставлении их с эффектом лечения по шкале, осно­ванной на процентном содержании позитивных клеток, нами не было отмечено ни достоверных раз­личий в экспрессии Bcl-2, Bak и Bax, ни значимой корреляции с эффектом терапии.

Тем не менее мы обратили внимание на то, что в группе эффекта от проводимой терапии в 100% клеток уровень экспрессии Bak не превышал 20%, в то время как в группе прогрессирования за­болевания только 58,3+10,1% клеток имели экс­прессию Bak в пределах 20% (табл. 7). В связи с этим мы проанализировали влияние минимальной экспрессии Bak на чувствительность пациентов к лечению интерферонами. Достоверность различий в данной категории между исследуемыми подгруп­пами была значительной (р<0,01), а коэффициент корреляции составил 0,42. Наличие повышения экспрессии Bak более 20% коррелировало с отсут-

Таблица 8.      Сравнение экспрессии CD95(FAS/Apol) у пациентов обеих групп

Степень экспрессии     Местно-распространенный РП       Метастатический РП

прогрессия        стабилизация     прогрессия эффект абс., n   отн., % абс., n   отн., % абс., n отн., %   абс., n отн., %

Нет	2	16,65	0	0	41,7	10	20	2
Слабая	4	33,35	8	40	33,3	8	60	6
Умеренная	4	33,35	6	30	16,6	4	20	2
Выраженная	2	16,65	6	30	8,4	2	0	0
Достоверность, p	>0,05				>0,05

Таблица 9.      Сравнение экспрессии PCNA у пациентов обеих групп

Степень Местно-распространенный РП       Метастатический РП

пролиферативной     прогрессия        стабилизация     прогрессия эффект активности абс., n   отн., %   абс., n   отн., %   абс., n   отн., % абс., n   отн., %

Низкая	0		0		2		10		6	25		2		20
Умеренная		12		100	8	40		6		25	4		40
Высокая		0		0	10	50		12		50	4		40

ствием эффекта иммунотерапии интерферонами. Факт несколько удивительный, поскольку Bak от­носится к проапоптотическим факторам и повы­шение его активности может приводить к усиле­нию апоптотической активности клеток. Однако, вероятно, при поздних стадиях РП происходят не­обратимые нарушения механизма регуляции кле­точного цикла, и повышение уровня Bak может свидетельствовать об отсутствии какого-либо кон­троля над клеточной пролиферацией.

При статистическом анализе результатов имму-ногистохимического исследования экспрессии CD95(FAS/Apo1) среди пациентов с местно-распро-страненным и метастатическим РП достоверных различий в оцениваемых подгруппах не получено. Значение коэффициента корреляции составило 0,2,

что свидетельствует об отсутст­вии значимой корреляции экс­прессии этого фактора с течени­ем заболевания при данной ста­дии РП. Как и в случае с р53, не­смотря на достоверные различия экспрессии CD95(FAS/Apo1) в группах местно-распространен-ного и метастатического РП, на­ми не было получено убедитель­ных данных о влиянии экспрес­сии CD95(FAS/Apo1) на эффект терапии. По всей видимости, снижение экспрессии CD95 (FAS/Apo1) с ростом стадии забо­левания свидетельствует о про­грессирующем повреждении ре-гуляторных механизмов в опухо­левой клетке (табл. 8).

При анализе экспрессии PCNA в группе местно-распро-страненного РП были выявлены достоверные различия в подгруп­пах прогрессирующего и стаби­лизировавшегося РП (табл. 9). У пациентов группы прогресси-рования заболевания (12 человек) 100% опухолевых клеток имели пролиферативную активность ниже 50% уровня. Из 20 пациен­тов со стабилизацией процесса на фоне лечения у 10 пролифератив-ная активность была ниже 50% (50,0+11,2%), а у второй полови­ны (10 пациентов - 50,0+11,2%)

определена высокая экспрессия PCNA. Достоверность различий достигла весьма значительного ^^^^^^^^Ш уровня (р <0,01), а модуль коэф­фициента корреляции составил 0,52, что свидетель­ствовало о значимой корреляции высокой пролифе-ративной активности с положительным эффектом интерферонов при местно-распространенном РП.

При анализе экспрессии PCNA среди пациен­тов с метастатическим поражением достоверных различий между подгруппами не выявлено (р>0,05). В обеих подгруппах около половины пациентов имели опухоли с высокой пролиферативной актив­ностью клеток. Однако, в отличие от местно-рас-пространенного процесса, этот критерий не внес информации о возможном прогнозе заболевания при наличии отдаленных метастазов. Коэффициент корреляции составил всего лишь 0,02, что не позво­лило нам причислить этот фактор к значимым при метастатическом РП.

При сравнении экспрессии Her-2/neu в груп­пах пациентов с местным распространением и ме­тастатическим поражением (табл. 10) достовер­ных различий степени экспрессии в изучаемых подгруппах и значимой корреляции его экспрес­сии нами не получено (р>0,05). Учитывая эти дан­ные, мы предполагаем, что экспрессия Her-2/neu не является характерным признаком РП при ме­стном распространении и метастатическом пора­жении, а также степень его экспрессии не корре­лирует с течением заболевания и эффективно­стью иммунотерапии.

Таким образом, в процессе канцерогенеза от­мечают прогрессивное нарушение регуляторных ме­ханизмов клеточного цикла при РП, что проявляет­ся отсутствием контроля над синтезом про- и анти-апоптотических молекул и их взаимодействием. Кроме того, в результате проведенной работы нами получены данные, позволяющие рассматривать фа­кторы апоптоза и пролиферации в качестве прогно­стических ориентиров при выборе тактики после­операционного ведения пациентов с местно-рас-пространенным и метастатическим РП.

Выводы

1. Для опухолевых клеток при местно-распространенном и метастатическом РП нехарактерны высокие уровни экспрессии белков семейства Bcl-2 и Her-2/neu, но им свойственна умеренная и высо­кая степень экспрессии PCNA. Экспрессия мутант-ного белка р53 и снижение экспрессии CD95(FAS/Apo1) присущи клеткам РП на стадии метастатического поражения.

2. При местно-распространенном РП отсутст­вие экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2 коррелирует с прогрессией заболевания. Экспрессия мутантного р53 и Bak, а также снижение экспрессии CD95(FAS/Apo1) - прогностически неблагоприят­ные факторы, коррелирующие с наличием отдален­ных метастазов.

3. Наличие экспрессии мутантного р53 и сни­жение экспрессии CD95(FAS/Apo1) с ростом стадии заболевания свидетельствуют о прогрессирующем повреждении регуляторных механизмов в опухоле­вой клетке, но не коррелируют с эффектом адъю-вантной терапии при местно-распространенном и метастатическом РП.

4. При повышении экспрессии Bak более 20% эффективность иммунотерапии интерферонами при метастатическом РП снижается. Высокая про-лиферативная активность опухолевых клеток кор­релирует с положительным эффектом интерферо-нов при местно-распространенном РП и не являет­ся значимым прогностическим фактором при мета­статическом РП.

1. Чиссов В.И., Старинский В.В., Пет­рова Г.В. Состояние онкологической помощи населению России в 2004 году.

М.; 2005.

2. Matthew A., Devesa S.S., Fraumeni J.F. Jr. et al. Global increases in kidney cancer incidence, 1973-92. Eur J Cancer Prev2002;11:171-8.

3. Flanigan R.C., Campbell S.C., Clark J.I. et al. Metastatic renal cell carcinoma. Current treatment options. Oncology

2003;4:385-90.

4. Mickisch G.H. Rational selection of a control arm for randomised trials in metastatic renal cell carcinoma. Eur Urol

2003;43:670-9.

5. Linechan S.H., Shipley W.U., Parkinson D.R. Cancer of the kidney and ureter. In: De Vita V.T. Ir., Ed. Cancer: principles and practice of oncology, 4th ed. Philadelphia,

J.B. Lippincot; 1993.

6. Гарин А.М., Хлебнов А.В. Справоч­ник практической химиотерапии опухо­лей. М., Росмэн; 1995.

7. Amato R.J. Chemotherapy for renal cell carcinoma. Semin Oncol 2000;27:177-86.

8. Fossa S., Droz J.P., Pavone-Macaluso M. et al. Vinblastine in Metastatic Renal Cell

Carcinoma: EORTC Phase III Trial 30882.

Eur J Cancer 1992;28a:878-80.

9. Yagoda A., Abi-Rached B., Petrylak D. Chemotherapy for advanced renal-cell car­cinoma: 1983-1993. Semin Oncol

1995;22:42-60.

10. Pyrhonen S., Salminen E., Ruutu M. et al. Prospective Randomized Trial of Interferon Alfa-2a Plus Vinblastine Versus Vinblastine Alone in Patients With Advanced Renal Cell Carcinoma. J Clin

Oncol 1999;17:2859-70.

11. Steiner G., Strander H., Carbin B.E. et al. Recombinante interferon alpha-2a and medroxyprogesterone in advanced renal cell carcinoma. A randomised trial.

Acta Oncol 1990;29:155.

12. Papac R.J., Keohane M.F. Hormonal therapy for metastatic renal cell carcinoma combined androgent and prover followed by high dose tamoxifen. Eur J Cancer

1993;29:997-9.

13. Bone Pain Trial Working Party. 8 Gy single fraction radiotherapy for the treat­ment of metastatic skeletal pain: ran­domised comparison with a multifraction schedule over 12 months of patient follow-up. Radiother Oncol 1999;52:111-21.

- Литература

14. Huguenin P.U., Kieser S., Glanzmann C. et al. Radiotherapy for metastatic carci­nomas of the kidney or melanomas: an analysis using palliative end points. Int J

Rad Oncol Biol Phys 1998;41:401-5.

15. Tretter C.P.G., Ernstoff M.S.

Chemotherapy, Hormonal therapy, and Interferons. Genitourinary Oncology, 2nd ed. Edited by N.J. Vogelzang, P.T. Scarding,

W.U. Shipley, D.S. Coffey. USA, Lippincott Williams and Wilkins; 1999. p. 248-59.

16. Kim H.L., Seligson D., Liu X. et al. Using tumor markers to predict the survival of patients with metastatic renal cell carci­noma. J Urol 2005;73(5):1496-501.

17. Vasavada S.P., Novick A.C., Williams B.R. P53, Bcl-2, and Bax expression in renal cell carcinoma. Urology

1998;51:1057-61.

18. Uzunlar A.K., Sahin H., Yilmaz F. et al. Expression of p53 oncoprotein and Bcl-2 in renal cell carcinoma. Saudi Med J

2005;26:37-41.

19. Cho D.S., Joo H.J., Oh D.K. et al.

Cyclooxygenase-2 and p53 expression as prognostic indicators in conventional renal cell carcinoma. Yonsei Med J

2005;46(1):133-40.

21