Рак шейки матки: причины, следствие, профилактика.

Рак шейки матки: причины, следствие, профилактика.

Гурцееич В.Э. Лаборатория вирусного канцерогенеза, ГУ Онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия

Введение

Несмотря на внедрение скринирующих мето­дов исследования, разработанных в 70-е годы, рак шейки матки (РШМ) является одним из наиболее ча­сто встречающихся новообразований у женщин. Еже­годно в мире диагностируется около 500 тысяч новых случаев РШМ, и около 300 тысяч женщин в год уми­рают от этого заболевания. Частота РШМ в России также остается высокой. По данным 2003 г., заболева­емость РШМ в стране составляет 11,5 случаев на 100 тыс. женского населения и занимает 5 место в струк­туре злокачественных новообразований у женщин. Важно отметить, что в России среди женщин в возра­сте 15-39 лет смертность от РШМ занимает 1 место, при этом в возрасте 20-30 лет преобладает дисплазия легкой степени (CIN I), в возрасте 30-40 лет - умерен­ная и тяжелая дисплазия (CIN II, III), а в возрасте 40-60 лет - инвазивные формы рака.рак матки

Вирусы папиллом человека (HPV) как этиоло­гический фактор РШМ

Исследования последнего десятилетия убеди­тельно продемонстрировали роль определенных ти­пов вирусов папиллом человека (HPV) в этиологии РШМ. Об этом свидетельствуют данные молекуляр-но-биологических исследований, показавших присут­ствие в опухолевой ткани РШМ последовательностей HPV, определяемых практически в 100% случаев при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). На этиологическую роль HPV указывают и результа­ты серологических исследований, в которых обнару­жение антител к различным антигенам вируса ассо­циировалась с повышенным риском заболевания этой формой рака матки. Эпидемиологическими исследования­ми было доказано, что латентное носительство HPV в 10 и более раз (до 100 раз) повышает риск возникно­вения РШМ. С другой стороны, среди населения с высокой заболеваемостью РШМ уровень инфициро-ванности женщин HPV оказался существенно выше при сравнении с населением с низкой частотой этого заболевания.

 

В настоящее время идентифицировано более 200 типов вирусов папиллом (HPV). При этом при­близительно 40 типов вызывают различные патоло­гии аногенитальной области человека. Две трети из них, включая высоко онкогенные типы HPV-16 и HPV-18, отнесены в т.н. группу высокого риска на основании их доказанной этиологической роли в возникновении РШМ. Показано, что 16-й и 18-й типы ответственны за 65%-75% случаев РШМ, а HPV-31, -33, -35, -39, -45, -51, -52, -56, -58, -59 или -66 - за 18%-20% случаев. Возникновение остальных случаев РШМ, по-видимому, обусловлено инфицированием другими типами вируса. Следует отметить, что в боль­шинстве стран мира, включая Россию, РШМ в 50-60% случаев ассоциированы с 16-м типом, в 10-15% слу­чаев- с 18-м типом, и по 4-5% случаев приходятся на 31-й и 45-й типы. К возникновению папиллом и кон­дилом гениталий причастны HPV-6 и HPV-11. Их обнаруживают с одинаковой частотой примерно у 1% сексуально активных мужчин и женщин, Интересно отметить, что за последние 30 лет заболеваемость кон­диломами и папилломами гениталий выросла при­мерно в 5 раз.рак матки

Способы заражения

Заражение HPV происходит главным обра­зом половым путем и чаще всего через поврежден­ный эпителий. Доказано, что большинство мужчин и женщин инфицируется вирусом в первые годы половой жизни, и процент инфицированных лиц с годами существенно возрастает. Не исключены пе­ринатальный и оральный пути передачи инфекции. В инфицированном эпителии синтез вирусной ДНК наиболее выражен в зернистом слое, в то время как экспрессия поздних генов и созревание вирусных частиц наиболее активно происходит в верхнем оро-говевающем слое (рис. 1Б). В половых органах ви­рус может персистировать достаточно долго, вызы­вая ту или иную патологию. Уже через 3 месяца пос­ле заражения можно наблюдать начальные патоло­гические изменения в области шейки матки, но про­ходит от 10 до 20 лет до возникновения инвазивного рака.

Следует отметить, что лишь у незначительного процента зараженных женщин возникает инвазивная форма рака шейки матки. Хотя инфицирование HPV сексуально активных лиц происходит довольно часто и достигает высокого уровня (до 75%), инфекция, как правило, носит транзиторный характер и в 90% слу­чаев уже через год вирус исчезает самостоятельно под воздействием иммунной системы организма. Тем не менее, примерно у 65% инфицированных женщин можно обнаружить начальные патологичес­кие изменения в шейке матки, которые со временем подвергаются обратному развитию. Если же вирусу удается преодолеть иммунологическую защиту и инфекция становится персистентной, то в шейке мат­ки возникают повреждения различной степени тяже­сти, включая инвазивный рак. В частности, пример­но у 10% инфицированных женщин возникает внут­риэпителиальная дисплазия (CIN) степени I, II или III, последняя еще называется карциномой in situ. И лишь у незначительной части этих больных (чаще всего с CIN-III) патологический процесс прогрессирует, при­водя к возникновению инвазивного рака (рис. 2). Ис­ход заражении 6-м и 11-м типами HPV совершенно иной. Инфицирование этими вирусами после латен­тного периода, длящегося иногда до 2-х до 5-ти лет, приводит к появлению папиллом и/или кондилом (рис.2).

Генетическая структура HPV

Все HPV относятся к группе паповавирусов и имеют сходную генетическую структуру. Каждый HPV построен из 72 капсомеров, не имеет липидной обо­лочки и содержит двунитевую кольцевую ДНК с диа­метром вириона 55 нм и размером генома 8 тыс. пар оснований. Вирусный геном существует либо в эпи-сомальной, либо в интегрированной в клеточный ге­ном формах. Геном HPV делят на 3 области: URR (вер­хнюю регуляторную область), E (раннюю регулятор-ную область) и L (позднюю регуляторную область). URR вовлечена в процессы репликации вируса и осу­ществляет контроль за транскрипцией некоторых пос­ледовательностей в Е-области. Е-область содержит 7 функциональных генов (Е1-Е7), кодирующих белки, ответственные за ранние этапы репликации вируса. L-область содержит 2 структурных гена (L1 и L2), ко­торые кодируют структурные белки вириона, необ­ходимые для формирования капсида на поздних эта­пах репликации вируса (рис. 1 А). Основными транс­формирующими генами HPV высокого риска явля­ются гены Е6 и Е7 и в некоторой степени Е5, экспрес­сия которых контролируются областью URR.

Молекулярные события, сопровождающие возникновение РШМ

 

Клеточные гены р53 и Rb (ретинобластомы) от­ветственны за репарацию повреждений в виде раз­личного рода генетических ошибок или мутаций, воз­никающих в процессе репликации клеток. Если по­вреждение не подвергается репарации, клетка разрушается под воздействием процесса, называемого апоптозом. При персистирующей HPV-инфекции анти-онкогенная активность р53 и Rb блокируется продуктами вирусных генов Е6 и Е7. В частности, бе­лок, кодируемый геном Е6, связывает и инактивирует опухолевый супрессор р53, что приводит к отмене удаления из организма необратимо поврежденных усиленно пролиферирующих клеток, нарушает кле­точный цикл и генетическую стабильность. Кроме того, белок Е6 повышает активность теломеразы че­ловека, что способствует иммортализации (бессмер­тию) клеток. Белок Е6 способен вызвать трансформа­цию клеток только в присутствии белка, кодируемого геном Е7. Белок, кодируемый геном Е7, способен самостоятельно вызвать трансформацию клеток, но его действие значительно усиливается в присутствии бел­ка Е6. Белок Е7 связывает ингибиторы циклин-зави-симых киназ, такие как р21 и р27, что позволяет по­врежденным клеткам проходить фазу G1. Этот белок связывает и инактивирует опухолевый супрессор рRb, существенно облегчая вход генетически модифици­рованных клеток в S фазу и способствуя таким обра­зом накоплению трансформированных клеток в орга­низме. В отличие от предыдущих генов, ген Е5 обла­дает слабым трансформирующим действием на клет­ки. Тем не менее, белок, кодируемый этим геном, усиливает тирозинкиназную активность рецепторов эпидермального фактора роста, а также стимулирует МАР-киназные каскады, что также нарушает нор­мальное функционирование клетки. Таким образом, каждый из 3-х упомянутых генов латентной инфек­ции HPV вносит свой вклад в нарушение сигнальных путей клетки, увеличение ее пролиферативной ак­тивности, накопление генетических изменений и ее малигнизацию на конечном этапе.

Кольпоскопия и цитологическое исследование

Так как в организме женщины, инфицирован­ной HPV, образуется все больше активно размножа­ющихся клеток, в слое ороговевающего эпителия шейки матки появляются различные изменения, вы­являемые с помощью кольпоскопического и цитологи­ческого исследований. При кольпоскопии спектр вы­являемой патологии может колебаться в широком ди­апазоне - от остроконечной кондиломы, иногда зак­рывающей зев шейки матки, и незрелой эпителиаль­ной метаплазии до картины тяжелой степени диспла-зии (CIN III) и инвазивного рака (рис. 3). При цитоло­гическом исследовании на первом этапе развития патологического процесса можно обнаружить кой-лоцитарную атипию (при которой ядра инфициро­ванных клеток смещаются в сторону и располагают­ся эксцентрично) с перинуклеарным просветлением цитоплазмы. Клетки ороговевающего эпителия в про­цессе прогрессирования болезни начинают менять­ся в размерах и форме, иногда изменения претерпе­вают и ядра. Около 60% таких случаев могут подверг­нуться обратному развитию (регрессии), 20-35% слу­чаев продолжают оставаться без изменений, и в ос­тавшихся 10-15% случаев возникает внутриэпители-альный рак с выраженными клеточными изменения­ми, сниженным соотношением ядро/цитоплазма и элементами митоза. Поскольку весь эпителий рого­вого слоя шейки матки замещается генетически из­мененными клетками, то возникает внутриэпители-альная дисплазия степени III (CIN III) или карцинома in situ (рис. 4). Комплексы размножающихся орого-вевающих клеток сначала проникают за пределы ба-зальной мембраны (микроинвазия), а с нарастанием числа этих клеток может произойти истинно массив­ная инвазия. Наиболее часто CIN III определяется у женщин в возрасте 25-29 лет, спустя примерно 4-7 лет после максимального проявления CIN I. У предста­вительниц белой расы инвазивный рак возникает при­близительно через 15 лет после пика проявлений CIN

III и диагностируется обычно в возрасте 40-45 лет.

Тестирование на ДНК HPV

В настоящее время разработаны 2 теста для обнаружения ДНК HPV - это полимеразная цепная реакция (ПЦР) и Hybrid Capture II test (HC II), разра­ботанный фирмой Digene и недавно одобренный в США Управлением по пищевым и лекарственным продуктам (Food and Drug Administration, FDA). Этот тест при использовании в одной из скринирующих программ по раннему выявлению РШМ, проводи­мой в США, показал высокую чувствительность (80­90%) и специфичность (57-89%). В последние годы тестирование на вирусную ДНК рекомендовано для определенной категории женщин, у которых цитоло­гический тест Папаниколау дал положительный ре­зультат. Существует мнение, что применение теста на вирусную ДНК как части скрининирующей про­граммы на РШМ в индустриально развитых странах может быть оправдано более длительными интерва­лами между скринингами. Кроме того, тестирование на вирусную ДНК помогает уточнять данные цито­логического исследования, улучшает диагностику сомнительных случаев и выявляет асимптоматичес-ких больных с высоким риском возникновения РШМ.

Специфическая профилактика и лечение рака шейки матки

Поскольку для РШМ этиологическая роль HPV является общепризнанной, было сделано предполо­жение, что вакцина, препятствующая размножению вируса, снизит частоту этого заболевания. При со­здании вакцины необходимо было следовать следую­щим принципам: вакцина против РШМ должна (а) быть поливалентной, (б) защищать неинфицирован-ных женщин (девочек) против заражения высокоон-когенными типами HPV и (в) лечить тех, кто уже ин­фицирован вирусом, в том числе женщин с патоло­гией шейки матки. В настоящее время создаются и испытываются как профилактические, так и лечеб­ные вакцины. Ряд фирм начинают международные испытания поливалентной превентивной вакцины, которая включает в себя HPV-16, -18, -11 и -6. Как уже упоминалось ранее, 16-й и 18-й типы HPV вызывают около 70% случаев РШМ, а 11-й и 6-й типы - до 90% всех вагинальных папиллом и кондилом.

В настоящее время созданные в эксперимен­тальных условиях профилактические вакцины (ПВ) генерируют высокие уровни блокирующих и нейт­рализующих антител. Полевые испытания показали, то такие вакцины, по-видимому, могут в значитель­ной мере предохранить население против персисти-рущих вариантов HPV и существенно снизить часто­ту сопровождающих эту инфекцию поражений шей­ки матки.

 

Для приготовления ПВ используют биологи­ческие системы, экспрессирующие капсидный бе­лок HPV L1, иногда в комбинации c капсидным бел­ком HPV L2. При этом формируются структуры, на­поминающие истинные вирионы, названные виру­соподобными частицами (VLP), которые представ­ляют собой пустые капсиды. Эти частицы не содер­жат опасную для организма вирусную ДНК, но об­ладают антигенными детерминантами вируса, на ко­торые вырабатываются антитела.

Высокоэффективные вакцины включают VLP, наиболее часто встречающихся типов HPV.

Из опубликованных данных следует, что пер­вые опыты применения таких вакцин дали вполне обнадеживающие результаты. Так, например, в ра­боте Koutsky et al. (2002) сообщается о том, что 768 женщин в возрасте 16-23 лет без признаков HPV-ин-фекции были вакцинированы вакциной, состоящей из VLP, содержащих на своей поверхности капсид-ный белок L1 HPV 16-го типа. Одновременно другая группа, состоящая из 765 женщин, была подвергнута псевдовакцинации введением плацебо. Обе группы наблюдали в течение 17,4 месяца. В результате оказа­лось, что транзиторная инфекция HPV-16 в вакцини­рованной группе была обнаружена у 6 женщин (0,8%) и 68 женщин (8,8%), вакцинированных плацебо. У женщин из вакцинированной группы ни персистент-ной инфекции, ни признаков дисплазии шейки матки обнаружено не было, в то время как в контрольной группе были выявлены и персистентная инфекция вирусом 16-го типа (у 41 женщины) и внутриэпители-альные поражения шейки матки, (CIN I - у 5 женщин, CIN II - у 4-х женщин). Два других крупномасштаб­ных исследования также показали высокую профи­лактическую эффективность как бивалентных (к HPV-16 и -18), так и тетравалентных (к HPV-6, -11, -16 и -18) L1-вакцин, приготовленных на основе VLP (Harper et al., 2004; Villa et al., 2005). Недавно группа амери­канских исследователей показала, что тестируемая ими бивалентная (анти-HPV16/18) L1-вакцина, приго­товленная с использованием VLP, в 100% случаев пре­дохраняла от возникновения внутриэпителиальных поражений шейки матки, ассоциированных c 16-м и 18-м типами вируса. Кроме того, эта вакцина была безопасной и проявляла высокие иммуногенные свой­ства на протяжении 4,5 лет (Harper et al., 2006). Со­гласно разработанным рекомендациям, вакцину вво­дят внутримышечно троекратно в сроки 0 и через 1-2 и 6 месяцев. При этом сероконверсия у ПЦР- и серо-негативных по HPV лиц наступает практически в 100% случаев. Титры вирусоспецифических антител со вре­менем снижаются, но антитела могли быть обнару­жены даже через 4 года. Окончательные доказатель­ства эффективности и безвредности этих вакцин бу­дут получены лишь через несколько десятилетий, ког­да вакцинированные девушки достигнут 40-45-летне­го возраста.

Профилактические вакцины в будущем будут полезны для молодых женщин и, может быть, моло­дых мужчин, ведущих активную половую жизнь, но станут широкодоступными лишь через 10-15 лет.

Нужно также учитывать, что пока профилакти­ческая вакцинация является достаточно дорогим ме­роприятием. В США, например, стоимость вакцина­ции, состоящей из 3-х инъекций, составляет €360, а в Европе - €465. Подсчитано также, что для того, что­бы предупредить 1 случай РШМ, необходимо сделать 350 вакцинаций в развитых странах и 200 в развиваю­щихся. В настоящее время среди официально разре­шенных для практического применения вакцин мож­но назвать тетравалентную L1-вакцину (Gardasil) про­тив HPV-16 и -18 (высокого риска), а также -6 и -11 (низкого риска). Двухвалентная вакцина (Gervarix) против HPV-16 и -18, вероятно, будет лицензирована в 2007 г.

При планировании в будущем широкого ис­пользования профилактических вакцин возникают вопросы, не имеющие пока ответов, в том числе: 1) какие возрастные группы должны быть вакциниро­ваны: только ли девочки в возрасте от 9 до 15 лет или также девушки и женщины старшего возраста; 2) дол­жны ли подвергаться вакцинации только ПЦР- и се-ронегативные по HPV женщины, или же вакцинацию можно также рекомендовать и не обследованным на вирус лицам; 3) нужно ли вакцинировать мальчиков и молодых людей половозрелого возраста; 4) не при­ведет ли вакцинация девочек-подростков к более ран­ней половой активности; 5) можно ли после вакцина­ции увеличивать интервалы между временем прове­дения скрининга женщин на РШМ?

Что касается лечебных вакцин (ЛВ), то экспе­риментальные варианты приготовлены в основном против HPV-16, а некоторые проходят клинические испытания. ЛВ предназначены для ликвидации оста­точных проявлений болезни после лечения внутри-эпителиальных поражений или инвазивного рака. Принцип действия вакцины - стимуляция иммунной системы против ранних вирусных белков (опухоле­вых антигенов) Е6 и/или Е7, препятствующих входу инфицированных клеток в апоптоз и фазу старения клеток. В результате возникает иммунный ответ, ко­торый разрушает опухолевые клетки, постоянно экс-прессирующие оба неструктурных ранних белка.

Готовятся ЛВ на основе пептидов, белков, а так­же химерных белков, содержащих фрагменты 2-х и более белков. При этом используются вирусные и бактериальные векторы, дендритные и модифициро­ванные опухолевые клетки. В экспериментальных условиях получены обнадеживающие результаты при испытании вакцин, приготовленные на базе реком-бинантного вируса осповакцины, экспрессирующе-го белки Е6 и Е7 16-го и 18-го типов, а также на базе пептидов Е7, слитных белков Е6 и Е7 и дендритных клеток.

Испытана с позитивным эффектом вакцина, приготовленная из химерных VLP, в которой 60 кар-бокси-терминальных аминокислот L1 HPV16 замене­ны фрагментами Е7 того же вируса. Изучаются воз­можности приготовления и других вариантов вакци­ны.

Факторы риска

В процесс HPV-ассоциированного канцероге­неза вовлекаются различные факторы риска, являясь его важными составляющими. К числу факторов, способствующих распространению вируса и, следо­вательно, увеличению заболеваемости РШМ следует отнести поведенческие, социальные, культурные и экономические. В частности, раннее начало половой

Статьи

23

жизни и многочисленность партнеров увеличивают возможность заражения HPV и другими инфекция­ми, передаваемыми половым путем. Эпидемиологи­ческие исследования показали, что у женщин, имев­ших в течение жизни 10 и больше половых партнеров, риск возникновения РШМ был в 3 раза выше, чем у женщин, имевших одного постоянного партнера. Этот риск увеличивался более чем в 2 раза при начале по­ловой жизни до 16 лет при сравнеии с лицами, всту­пившими в половые отношения в возрасте 22 лет и старше. В этой связи важно отметить наблюдаемую в последние годы негативную тенденцию к более ран­нему началу сексуальных контактов девочек-подрос­тков в России: примерно 40-50% из них начинают по­ловые контакты в возрасте 13-16 лет. Раннее начало половой жизни сопряжено не только с повышенным риском возникновения РЖМ и других заболеваний, передаваемых половым путем, но и с угрозой серь­езной патологии половой сферы и, как результат, с потерей способности к деторождению. Сексуальное поведение половых партнеров женщин также имеет значение в плане опасности заражения женщин ви­русом. Оказалось, что у женщин, заболевших РШМ, мужья более чем в 5 раз чаще имели 20 и более поло­вых партнерш, чем мужья здоровых женщин. Среди других факторов риска, влияющих на уровни заболе­ваемости РШМ, следует назвать курение табака, по­скольку доказано, что никотин и другие продукты го­рения сигарет концентрируются на слизистой обо­лочке шейки матки, приводя к подавлению иммун­ной активности клеток Лангерганса (дендритных кле­ток). В принципе, любые воздействия, включая ВИЧ инфекцию, приводящие к ослаблению иммунитета, облегчают процесс HPV-инфицирования, способству­ют активации ранее приобретенной инфекции и, в конечном итоге, приводят к возникновению опухоли. Хроническое использование кортикостероидов (на­пример при астме) и комбинированных оральных контрацептивов также может играть важную роль в развитии опухолевого процесса в шейке матки.

Заключение

РШМ является одной из наиболее часто встре­чающихся злокачественных опухолей у женщин. В структуре онкологических заболеваний это новооб­разование занимает первое место в развивающихся странах и одно из первых мест в европейских странах, включая Россию. Этим объясняется тот интерес, ко­торый проявляется к изучению РШМ во многих кли­никах и лабораториях мира. После многолетних ис­следований было доказано, что возникновение РШМ инициируется высоко онкогенными штаммами HPV, в подавляющем большинстве случаев 16-м и 18-м ти­пами. В связи с этими данными перед учеными воз­никла очередная задача - создать антивирусную вак­цину для профилактики и лечения РШМ. В настоя­щее время пробные серии таких вакцин созданы, не­которые из них уже лицензированы и доступны для использования, другие проходят различные этапы клинических испытаний. Сам факт изготовления и успешного применения антивирусных вакцин для предупреждения предраковых и лечения опухолевых поражений шейки матки, знаменует собой начало эры применения эффективных противораковых вак­цин. Таким образом, впервые фундаментальные ис­следования, обнаружившие HPV высокого риска и доказавшие их канцерогенность для человека, были успешно внедрены в клиническую практику. На сле­дующем этапе важнейшая задача состоит в соответ­ствующей просветительской работе среди населения и во внедрении в протоколы скрининга РШМ тести­рования на ДНК HPV в качестве дополнительного те­ста к цитологическому исследованию. Если будут со­зданы эффективные и доступные для широкого при­менения вакцины, усовершенствована диагностика заболевания, и до сознания масс будет доведена ис­тина о безопасном сексе, появится реальная надежда на существенное сокращение инфекций, передавае­мых половым путем и, соответственно, возможность снижения заболеваемости РШМ.

Литература

1. WHO/47. Press Release. Cervical Cancer: Expert Confirm Virus a Major Cause? New Detection Technologies Available/ 3 July, 1996.

2. WHO. Human papilloma virus (HPV). Summary of Data Reported and Evaluation. 1995.

3. Канцерогенез. Ред. Д.Г. Заридзе. Медицина, Моск­ва, 2004.

4. International Agency for Research on Cancer. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans; Human Papillomaviruses. Lyon, WHO. V90,

2005.

5. Zumbach R, Kisseljov F, Sacharova O, Shaichaev G, Semjonova L, Pavlova L, and Pawlita M. Antibodies against oncoproteins E6 and E7 of human papilloma virus types 16 and 18 in cervical carcinoma patients from Russia. Int. J. Cancer, 85, 313-318, 2000.

6. Clifford GM, Smith JS, Plummer M, Munoz N, Franceschi S. Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta-analysis. Br J Cancer. 2003, 88, 1, 63-73.

7. Fehrmann F, Laimin LA. Human papillomaviruses: targeting differentiating epithelial cells for malignant transformation. Oncogene. 2003 Aug 11; 22(33):5201-7. Review.

8. Kim YT, Zhao M. Aberrant cell cycle regulation in cervical carcinoma. Yonsei Med J. 2005 Oct 31; 46(5):597-613. Review.

9. Feeley C. Advances in cervical cancer screening and human papillomavirus vaccines. J Br Menopause Soc. 2006 Mar;12 (1):19-23.

10. Hebner CM, Laimins LA. Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Rev Med Virol. 2006 Mar-Apr; 16 (2):83-97. Review.

24

Русский журнал «СПИД, рак и общественное здоровье» (2007) Т. 11, № 1

11. Koutsky et al. A controlled trial of a human papillomavirus Type 16 vaccine. New Engl. J. Med. 2002, б, 347: 1645-51.

12. Harper, D.M., Franco, E.L., Wheeler, C.M., Ferris, D.G., Jenkins, D., Schuind, A., Zahaf, T., Innis, B., Naud, P., de Carvalho, N.S., Roteli-Martins, C.M., Teixeira, J., Blatter, M.M., Korn, A.P., Quint, W., and Dubin, G. and GlaxoSmithKline HPV Vaccine Study Group. Efficacy of a bivalent L1 virus-like particle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18 in young women: a randomised controlled trial. Lancet, 2004,

364: 1757-1765.

13. Villa, L.L., Costa, R.L., Petta, C.A., Andrade, R.P.,

Ault, K.A., Giuliano, A.R., Wheeler, C.M., Koutsky, L.A., Malm, C., Lehtinen, M., Skjeldestad, F.E., Olsson, S.E., Steinwall, M., Brown, D.R., Kurman, R.J., Ronnett, B.M., Stoler, M.H., Ferenczy, A., Harper, D.M., Tamms, G.M., Yu. J., Lupinacci, L., Railkar, R., Taddeo, F.J., Jansen, K.U., Esser, M.T., Sings, H.L., Saah, A.J., and Barr, E. Prophylactic quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16, and 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomised double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial. Lancet Oncol., 2005,

6: 271-278.

14. Harper DM, Franco EL, Wheeler CM, Jenkins D, Moscicki AB, Romanowski B, Roteli-Martins CM, Schuind A, Costa Clemens SA, Dubin G; HPV Vaccine Study group. Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus types 16 and 18: follow-up from a randomised control trial. Lancet. 2006,3,67: 1247-1255.