НОВЫЕ ПОДХОДЫ К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРОСТАТЫ.

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРОСТАТЫ.

Л.И. Ковалев, С.С. Шишкин, П.З. Хасигов , Н.К. Дзеранов, А.В. Каза-ченко, М.А. Ковалева, И.Ю. Торопыгин, Л.С. Еремина, С.В. Грачев,Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН,

НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова;НИИ урологии МЗ РФ;НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН.

Резюме. Целью работы являлось сравнительное изучение белков проста­ты у больных, оперированных по поводу гиперплазии или рака. При фрак­ционировании методом двумерного электрофореза по О‘Фарреллу получали около 630 белковых фракций из каждого образца тканей. Сравнение двух групп образцов («гиперплазия» и «рак») показало существование различий между ними по семи белкам, среди которых удалось идентифицировать из­вестные изоформы глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, альфа-коллагена и несколько мало изученных белков. В частности, у большинства обследованных больных раком наблюдалось появление дополнительного белка, обладавшего молекулярной массой 19 килодальтон и изоэлектриче-ской точкой 9,0. По результатам масс-спектрометрии этот белок идентифи­цировали как андроген-индуцируемый секретируемый белок AGR2, который рассматривается как потенциальный онкомаркер. Обсуждаются перспективы использования некоторых постгеномных технологий для выявления новых диагностических маркеров рака простаты.

Ключевые слова: рак простаты, онкомаркеры, двумерный электрофорез

Введение. Высокие темпы роста заболеваемости раком предстательной железы (РПЖ), вышедшего по этому показателю на первое место среди других онкологиче­ских заболеваний, и обширный контингент мужчин, относящийся к группе риска, делают проблемы РПЖ весьма актуальными, что привлекает к ним внимание не только урологов и онкологов, но также биохимиков, молеку­лярных биологов и других специалистов смежных специальностей [1,2,3].

До недавнего времени считалось, что проблему точной диагностики РПЖ может решить анализ в крови так называемого простат-специфического ан­тигена (ПСА). Однако за последние 2-3 года появился целый ряд публика­ций о том, что уровень ПСА часто не коррелирует с РП, а отражает лишь размеры гиперплазированной предстательной железы [4,5]. Как результат, в США, а также в других западных странах начаты активные поиски новых, более эффективных онкомаркеров РПЖ [6,7,2,5,8,9].

Качественно новые возможности для системных поисков молекулярных маркеров различных патологических процессов создало развитие в насту­пившем столетии так называемых постгеномных технологий, во многом свя­занных с разработками международного проекта «Геном человека» [10,11]. Особенно активно эти технологии применяются при изучении опухолевой трансформации, включая процессы формирования злокачественных новооб­разований в простате [2,7].

Среди постгеномных технологий значительное мест занимают проте-омные технологии, в числе которых двумерный электрофорез по О‘Фарреллу, методы масс-спектрометрии, иммуноблоттинг и ряд других [12,13,14]. В цели данной работы входило исследование с помощью проте-омных технологий различий белковых паттернов в образцах тканей проста­ты, полученных от больных гиперплазиями и раком, в интересах выявления потенциальных молекулярных маркеров РПЖ.

Материал и методы. Материалом для исследований послужили образ­цы тканей простаты человека, полученные при хирургических операциях, которые проводились в НИИ урологии МЗ РФ больным в связи с гиперплази­ей (n = 7) или по поводу РП (n = 5). Диагностика заболевания (включая опре­деление стадии рака по Глиссону) осуществлялась в НИИ урологии МЗ РФ с использованием клинических, гистологических и иммунохимических (опре­деление уровня простат-специфического антигена) методов. До начала ис­следований образцы обычно хранились 1-2 недели при температуре -70°.

Приготовление белковых экстрактов, контрольные исследования элек­трофорезом по методу Лэммли, проведение их фракционирования методом двумерного электрофореза по О‘Фарреллу в собственной модификации, ви­зуализацию белков окрашиванием кумасси голубым R-250 и азотнокислым серебром, а также определение положения маркеров молекулярных масс и ИЭТ при анализе полученных двумерных электрофореграмм (2DE) выпол­няли как описано ранее [15,16]. Денситометрию анализируемых фрагментов 2DE проводили, используя демонстрационную версию компьютерной про­граммы Melanie 3 (GeneBio, Швейцария).

Обработку гелей, гидролиз трипсином и экстракцию пептидов проводи­ли согласно протоколам [17] с некоторыми модификациями [13]. 0,5 мкл об­разца смешивали на масс-спектрометрической подложке с таким же объемом раствора 10 мг/мл 2,5-дигидроксибензойной кислоты ("Sigma", США) в 20%-ном ацетонитриле, содержавшем 0,1% трифторуксусной кислоты, и высуши­вали на воздухе. Масс-спектры получали на MALDI-времяпролетном-масс-спектрометре Ultraflex (Bruker, Германия) с УФ-лазером (336 нм) в режиме положительных ионов в диапазоне масс 500-8000 Да и калибровали их, ис­пользуя известные пики аутолиза трипсина. Идентификацию белков прово­дили с помощью программы Mascot (Matrixscience, США) по базам данных Национального центра биотехнологической информации США , принимая точность определения массы ионов равной 0,01% и допуская возможность модификации цистеинов акриламидом и окисления метионинов.

Результаты. Для сравнительного изучения особенностей белковых паттернов в тканях простаты человека при гиперплазии и при раке были ис­пользованы биоматериалы, полученные в ходе операций у больных с соот­ветствующими диагнозами. Общие данные об этих больных представлены в таблицах 1 и 2.

Предварительный анализ полученных биоматериалов электрофорезом по методу Лэммли показал достаточно хорошее соответствие белковых профилей во всех изучавшихся пробах (Рис. 1), что позволило перейти к их изучению протеомными технологиями.

Двумерный электрофоретический анализ обеспечил выявление в каж­дом из изучавшихся образцов по 230-250 белковых фракций при окраске Кумасси R-250 и 630-650 фракций при окраске серебром. На Рис. 2 в качест­ве примера приведены обзорные двумерные электрофореграммы белков, по­лученные при фракционировании одного из образцов в группе «гиперпла­зия».

При сравнительном изучении белков в образцах с гиперплазией и в об­разцах с раком простаты удалось обнаружить несколько характерных отли­чий. Содержание некоторых белков оказалось более высоким в образцах с РПЖ, а некоторых - в образцах с гиперплазией. Области нахождения таких белков очерчены прямоугольниками на Рис. 2Б.

Методом масс-спектрометрии в этих областях были идентифицированы следующие белки: изоформа альфа-коллагена (1), дисульфид изомераза бел­ков ER60 (2), изоформы глицеральдегид-3-фосфат дегидрогенезы (3), не охарактеризованный пока простатный белок, который зарегистрирован в банке данных NCBI под номером MGC12197 (4), белок AGR2 (5) и белок, обозначаемый как D-цепь комплекса фибрина (6). Некоторые общие характе­ристики идентифицированных белков суммированы в таблице 3.

При этом особое внимание привлекали изменения, наблюдавшиеся на двумерных электрофреграммах в области 5. Идентифицированный там бе­лок AGR2 был зарегистрирован в указанной области при анализ четырех об­разцов раковой ткани (из имевшихся пяти) и ни разу не обнаруживался в об­разцах с гиперплазией (Рис. 3). Таким образом, по полученным результатам белок AGR2 представляет значительный интерес, как один из потенциаль­ных диагностических маркеров рака предстательной железы. Вместе с тем, представляется перспективным продолжение исследований других белков, содержание ко­торых изменяется при РП.

Обсуждение. Очевидно, что возможности эффективного (хирургиче­ского, химиотерапевтического и др.) лечения РП во многом определяются своевременностью и точностью диагностики, для которой особое значение имеет определение соответствующих биохимических маркеров. Обнаруже­ние в конце 30-ых годов прошлого века первого биохимического маркера РПЖ - кислой простатспецифичной фосфатазы было связано с развитием ме­дицинской энзимологии, а эру ПСА обеспечило внедрение в лабораторную практику методов иммунохимии [3,4 и по базам данных NCBI]. В настоящее время для обнаружения потенциальных маркеров РПЖ широко используются постгеномные технологии, позволяющие проводить массовые исследования продуктов генной экспрессии как на уровне мРНК (транскриптомика), так и на уровне белков (протеомика) [18,7]. С помощью постгеномных технологий уже выявлены и активно изучаются более десятка потенциальных молеку­лярных маркеров РПЖ. Некоторые из них приведены в таблице 4.

В мае 2005 года появились первые сообщения о том, что в раковых клетках простаты (и в некоторых других злокачественных опухолях) значи­тельно увеличивается экспрессия гена AGR2, кодирующего андроген-индуцируемый и секретируемый белок, [19,20]. Более того, по данным Лиу и др. [20], а также Смирнова и др. [21] увеличение экспрессии гена AGR2 непосредственно связано с приобретением раковыми клетками способности к метастазированию.

Выявление в данной работе белка AGR2 в клетках РП протеомными технологиями полностью согласуется с недавними аналогичными результа­тами, полученными транскриптомными технологиями и иммунохимически-ми методами [19,20]. Поскольку, белок AGR2 является секреторным, то, по всей видимости, можно ожидать повышение содержания этого белка в крови при РП. Соответственно, создание и клинические исследования иммунохи-мического диагностикума на белок AGR2 могут представлять значительный интерес в свете необходимости разрешения проблем молекулярной диагно­стики РП. Несомненно, приходу в клинику диагносткиумов на этот белок и/или на другие изучаемые потенциальные маркеры РП, должен предшест­вовать период значительных биотехнологических разработок, однако, учи­тывая важность проблемы и интенсивность ведущихся за рубежом исследо­ваний, можно полагать, что этот период не будет очень продолжительным. Для отечественных специалистов еще есть возможность принять участие в подобных разработках.

ЛИТЕРАТУРА

1. Mikolajczyk S.D., Song Y., Wong J.R., et al. // Clin. Biochem. - 2004. - Vol. 37, N 7. - P. 519-528.

2. Qin S., Ferdinand A.S., Richie J.P., O‘Leary M.P., Mok S.C., Liu B.C. // Pro-teomics. 2005. V.5. P.3183-3192.

3. Злокачественные новообразования в России в 2002 году. (Заболеваемость и смертность). Ред. В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. Москва.: из-во "МЕДпресс-информ". 2004. С.5-22.

4. Stamey T.A., Caldwell M., McNeal J.E., Nolley R., Hemenez M., Downs J. // J. Urol. 2004. V.172. P.1297-1301.

5. Hutchinson L.M., Chang E.L., Becker C.M., Shih M.C., Brice M., DeWolf W.C., Gaston S.M., Zetter B.R. // Prostate. 2005. V.64. P.116-127.

6. Solassol J., Marin P., Demettre E., Rouanet P., Bockaert J., Maudelonde T., Mange A. // Anal. Biochem. 2005. V.338. P.26-31.

7. Liu A.Y., Zhang H., Sorensen C.M., Diamond D.L. // J. Urol. 2005. V.173.

P.73-78.

8. Jiang Z., Woda B.A., Wu C.L., Yang X.J. // Am. J. Clin. Pathol. 2004. V.122.P.275-289.

9. Jiang Z., Li C., Fischer A., Dresser K., Woda B.A. // Am. J. Clin. Pathol. 2005.V.123. P.231-236.

10. Woychik R.P, Klebig M.L., Justice M.J. , Magnuson TR, Avner ED. // Mutat. Res. 1998 May 25;400(1-2):3-14

11. Epstein J.A., Rader D.J., Parmacek M.S. // Endocrinology. 2002. V143(6):

2045-2050.

12. Anderson N.G. Matheson A., Anderson L. // Proteomics. - 2001. - Vol.1. - P.3-

12.

13. Говорун В.М., Мошковский С.А., Тихонова О.В., Гоуфман Е.И., Сереб­рякова М.В., Момыналиев К.Т., Лохов П.Г., Хряпова Е.В., Кудрявцева Л.В., Смирнова О.В., Торопыгин И.Ю., Максимов Б.И., Арчаков А.И. // Биохимия.

8

2003. Т.68. С.52-60.

14. Шишкин С.С., Ковалев Л.И., Ковалева М.А. // Биохимия. 2004, т.69, №11,

С.1574-1589.

15. Kovalyov L.I., Shishkin S.S., Efimochkin A.S., Kovalyova M.A., Ershova E.S., Egorov T.A., Musalyamov A.K. // Electrophoresis. 1995. V.16. P.1160-

1169.

16. Пуляева Е.В., Ковалёв Л.И., Цветкова М.Н., Шишкин С.С., Болдырев Н.И.

// Биохимия. 1990. Т.55. С.489-498.

17. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. (1996) Anal. Chem. 1996.

V.68. P.850-858.

18. Ashida S., Nakagawa H., Katagiri T., et al. // Cancer Res. 2004. V.64(17):

5963-5972.

19. Zhang J.S., Gong A., Cheville J.C., Smith D.I., Young C.Y. // Genes Chromo­somes Cancer. 2005. V.43. P.249-259.

20. Liu D., Rudland P.S., Sibson D.R., Platt-Higgins A., Barraclough R. // Cancer

Res. 2005. V.65. P.3796-3805.

21. Smirnov D.A., Zweitzig D.R., Foulk B.W., Miller M.C., Doyle G.V., Pienta K.J., Meropol N.J., Weiner L.M., Cohen S.J., Moreno J.G., Connelly M.C., Ters-tappen L.W., O‘Hara S.M. // Cancer Res. 2005. V.65. P.4993-4997.

22. Wu H.H., Lapkus O., Corbin M. // Appl. Immunohistochem Mol. Morphol.

2004. V.12(4):285-289.

23. Wu J.D., Higgins L.M., Steinle A., Cosman D., Haugk K., Plymate S.R. // J. Clin. Invest. 2004. V.114(4):560-568.

24. Kristiansen G., Pilarsky C., Wissmann C., Kaiser S., Bruemmendorf T., Roepcke S., Dahl E., Hinzmann B., Specht T., Pervan J., Stephan C., Loening S., Dietel M., Rosenthal A. // J Pathol. 2005. V.205(3):359-376.

25. Zhigang Z., Wenlv S. // Jpn. J. Clin. Oncol. 2004. V.34(7):414-419.

26. Ghosh A., Heston W.D. // J. Cell. Biochem. 2004. V.91(3):528-539.

9

Таблица 1. Общие данные о пациентах с доброкачественной гиперплазией простаты (ДГПЖ).

Номер образца	Код - номер истории бо­лезни	Доопераци-онный диаг­ноз	Возраст	Результаты морфологиче­ского анализа образца ткани	ПСА* нг/мл
1	05597/04	ДГПЖ, вы­раженный склероз стромы	71	ДГПЖ, выра­женный скле­роз стромы, воспаление
2	05203/04	ДГПЖ,	65	ДГПЖ,	-
3	05731/04	ДГПЖ,	69	ДГПЖ, выра­женный скле­роз стромы, воспаление
4	03832/04	ДГПЖ, вы­раженный склероз стромы, вос­паление	72	ДГПЖ, возрас­тные измене­ния
5	006/05	ДГПЖ	63	ДГПЖ, возрас­тные измене­ния	12
6	0310/05	ДГПЖ	75	ДГПЖ, возрас­тные измене­ния	1,5
7	0538/05	ДГПЖ	63	ДГПЖ	6,87

* Содержание простат-специфического антигена (ПСА) в крови пациента до операции

10

Таблица 2. Общие данные о пациентах с раком простаты (аденокарци-номы).

№	№ и/б	Дооперационный ди­агноз	Воз­раст	Результаты морфоло­гического анализа образца ткани	ПСА нг/мл
1	0170/05	Аденокарцинома 2, стадия по Глиссону 7	65	Аденокарцинома 2, стадия по Глиссону 7	17,9
2	0179/05	Аденокарцинома 2 стадия по Глиссону 7	57	Аденокарцинома 2; стадия по Глиссону 7	20,0
4	0650/05	Аденокарцинома 2 стадия по Глиссону 6	67	Аденокарцинома 2; стадия по Глиссону 7	5,9
5	736/05	Аденокарцинома 2 стадия по Глиссону 7	65	Аденокарцинома 3; стадия по Глиссону 7	18,9
6	3069/05	Аденокарцинома 2 стадия по Глиссону 7	57	Аденокарцинома 2; стадия по Глиссону 7	23,0

11

Таблица 3. Белки простаты, выявившие некоторые различия между группами «гиперплазия» и «рак», которые удалось идентифицировать с помощью вре­мя-пролетной (MALDI-TOF) масс-спектрометрии.

№	Наименова­ние белка	№ Gene-Bank	% совпаде­ния*	Мм/pI** (эксп.)	Мм/pI** (расчет­ные)
1***	Глицераль-дегид-3-фосфат де-гидрогеназа	31645	53	36,0/7,2	36,0/8,26
2	Глицераль-дегид-3-фосфат де-гидрогеназа	31645	62	36,0/7,3	36,0/8,26
3	Дисульфид изомераза белков ER60	7437388	46	52,0/6,1	56,7/5,98
4     Белок AGR2 37183136           64          19,0/9,0 19,0/9,0
5	Белок MGC12197 простаты	14714462	25	32,0/6,9	31,5/10,7
6	D цепь фибриново-го комплек­са	28373951	36	10,0/9,6	10,2/9,30
7	Альфа 2 коллаген	1070605	13	130/6,3	129,5/9,1

* % совпадения выявленных триптических пептидов с последовательностью белка.

** Мм/pI - значения молекулярных масс (Мм) в килодальтонах и изоэлек-трических точек (pI).

*** - 1,2 - замена изоформ (возможно из-за разных посттрансляционных мо­дификаций), 3 - увеличивается количество при раке, 4 - появляется при раке, 5 - уменьшается при раке, 6 - увеличивается количество при раке, 7 - увели­чивается количество при раке.

12

Таблица 4. Некоторые изучаемые белковые маркеры РП, выявленные с помощью постгеномных технологий.

Название маркера (английский термин и символы ге­на)	Некоторые ссылки
1. Рацемаза (alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)	[18]
2. Высокомолекулярный цитокератин (High-molecular-weight keratin 34betaE12)	[22]
3. Белок р63, - гомолог белка p53 ()	[22]
4. Тимозин-бета 15 (Thymosin beta15)	[5]
5. Белки из главного комплекса гистосовместимости (MHC class I chain-related molecules, MICs)	[23]
6. Белки клеточной дифференцировки (CD166/MEMD and CD24)	[24]
7. Антиген простатных стволовых клеток (Prostate stem cell antigen, PSCA)	[25]
8. Опухолевый простат-специфичный мембранный антиген (Tumor target prostate specific membrane anti­gen, PSMA)	[26]